于 音,趙興利*,田 宇,邵佳甲,郭永川,付 堯,梁前壘,李衍鑫

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科,吉林 長(zhǎng)春 130033;2.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化及免疫組化鑒定

于 音1,趙興利1*,田 宇1,邵佳甲2,郭永川1,付 堯1,梁前壘1,李衍鑫1

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科,吉林 長(zhǎng)春 130033;2.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

目的建立體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的方法,體外誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化。方法應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從大鼠股骨、脛骨中分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng),以形態(tài)學(xué)方法鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征,利用含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM及含200μ mol/L BHA、2%DMSO的無血清DMEM誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,并通過免疫組化方法鑒定。結(jié)果經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形,類似于成纖維細(xì)胞;成神經(jīng)元誘導(dǎo)24 h后,多數(shù)MSCs變?yōu)榈湫偷纳窠?jīng)元樣細(xì)胞,胞體向胞核收縮并有較多的長(zhǎng)突起,免疫組化顯示神經(jīng)元特異性標(biāo)志NSE、神經(jīng)巢蛋白Nestin染色陽性。結(jié)論體外成功的進(jìn)行了MSCs原代及傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖迅速并可多次傳代,經(jīng)誘導(dǎo)后具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化潛能。

骨髓;間充質(zhì)干細(xì)胞;誘導(dǎo);大鼠;分化

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0991)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓組織中多種干細(xì)胞的混和體,因其具有取材方便、擴(kuò)增迅速、可自體移植并且具有多分化潛能等特點(diǎn)[1,2]近年來越來越受到關(guān)注。MSCs與神經(jīng)組織修復(fù)、骨、軟骨組織修復(fù)、肌組織、肌腱組織修復(fù)以及皮膚創(chuàng)面愈合等都有很密切的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)從大鼠骨髓中取出骨髓基質(zhì)細(xì)胞后進(jìn)行體外原代及傳代培養(yǎng),經(jīng)過多次傳代以獲得較純的MSCs,從形態(tài)學(xué)上觀察和鑒定MSCs,誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化,證實(shí)其具有神經(jīng)元樣分化潛能。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 120-180 g Wistar大鼠20只;低糖DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清FBS,0.25%胰蛋白酶,Percoll分離液,bFGF,BHA,DMSO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 取Wistar大鼠,3%戊巴比妥鈉按10mg/kg體質(zhì)量的劑量行腹腔注射麻醉。無菌條件下,暴露左右兩側(cè)股骨及脛骨表面,用一只固定有18號(hào)針頭內(nèi)含0.1 mL肝素(3 000 U/mL)的5 mL注射器從骨髓中抽取2 mL骨髓液,抽吸物用PBS溶液沖洗3次后,用DMEM培養(yǎng)基懸浮,將單細(xì)胞懸液緩慢加在1.073 g/cm3的Percoll分離液上部,350 g離心30 min,然后小心吸取位于分離液中間的乳白色細(xì)胞層,DMEM重懸后180 g離心5 min,以3×106密度接種于培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),接種后72 h首次換液,置換以新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,每3 d換液,第7天首次傳代,將已經(jīng)70%-80%長(zhǎng)滿的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,再用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,以1∶2比例接種于新培養(yǎng)瓶中,以后每3 d換液,待細(xì)胞70%-80%長(zhǎng)滿時(shí)再次傳代。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察 40及100倍倒差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征。

1.2.3 MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化及免疫組化鑒定

1.2.3.1 定向誘導(dǎo)分化 取第3代細(xì)胞,接種于24孔培養(yǎng)板,每孔約1×105個(gè)細(xì)胞,分對(duì)照組及誘導(dǎo)組,對(duì)照組不加入誘導(dǎo)劑,待細(xì)胞80%融合時(shí),誘導(dǎo)組加入含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM(10%FBS)預(yù)誘導(dǎo)24 h,更換培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,再加入含200 μ mol/L BHA、2%DMSO的無血清DMEM 誘導(dǎo),每3 d換液,共培養(yǎng)6 d;

1.2.3.2 免疫組化鑒定 誘導(dǎo)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌5次,每次3 min,3%過氧化氫室溫孵育10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶,之后用正常山羊血清封閉,室溫10 min,分別加入兔抗大鼠NSE 多抗(1∶100稀釋)、Nestin多抗(1∶100稀釋)、GFAP多抗(1∶100稀釋),濕盒4℃過夜后洗滌,生物素標(biāo)記二抗37℃孵育30 min,鏈霉親合素-過氧化物酶溶液37℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水(75%,85%,95%,100%),二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù),隨機(jī)數(shù)取10個(gè)非重疊視野(×100),計(jì)算NSE和Nestin陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例,以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 細(xì)胞約24 h貼壁,48 h后貼壁細(xì)胞明顯增多,并開始分裂增殖,圓形細(xì)胞變形伸出偽足,約7 d可70%-80%長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁,此時(shí)細(xì)胞逐漸融合成單層,形態(tài)變?yōu)閳A形、多角形、梭形或不規(guī)則形,呈集落狀生長(zhǎng),并出現(xiàn)核分裂相,細(xì)胞常圍繞集落中央呈島狀分布,可重疊生長(zhǎng),并分泌大量基質(zhì)。傳代后細(xì)胞約24h貼壁,逐漸伸展為梭形、紡錘形、多角形,胞體較原代略膨大,3-5 d即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁。連續(xù)傳代后,細(xì)胞逐漸變?yōu)樾螒B(tài)更均一、排列更有序的成纖維細(xì)胞樣。

2.2 神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化及免疫組化鑒定

2.2.1 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)觀察 預(yù)誘導(dǎo)24 h后,原來梭形的MSCs胞體發(fā)生收縮,體積變小,立體感增強(qiáng),細(xì)胞邊緣變得不規(guī)整,并出現(xiàn)許多細(xì)的突起,胞體類似于錐形或球形(見圖1)。誘導(dǎo)2 h后,少數(shù)MSCs開始出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化,胞質(zhì)向胞核收縮,呈典型的核質(zhì)體形態(tài),胞體逐漸變成圓形或錐形,且折光性增強(qiáng),胞體周圍具有較強(qiáng)的光暈,突起繼續(xù)延長(zhǎng)(見圖2);在誘導(dǎo)后5-24 h中,MSCs逐漸開始向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,數(shù)量隨時(shí)間不斷增多,形成雙極或多極細(xì)胞,類似于樹突結(jié)構(gòu)(見圖3);24 h后,多數(shù)MSCs變?yōu)榈湫偷纳窠?jīng)元樣細(xì)胞,其胞體向胞核收縮成錐形且變得致密而有折光性,有較多的長(zhǎng)突起,有些長(zhǎng)突起末端形成長(zhǎng)錐樣的膨大及絲狀偽足。多個(gè)神經(jīng)元樣細(xì)胞的突起可相互延伸并形成網(wǎng)狀(見圖4)。

2.2.2 免疫組化鑒定 為了進(jìn)一步證實(shí)誘導(dǎo)分化出來的神經(jīng)元樣細(xì)胞,分別進(jìn)行了神經(jīng)元特異性標(biāo)志NSE、神經(jīng)巢蛋白Nestin和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志GFAP的免疫組化染色分析,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體及部分突起NSE和Nestin染色呈陽性(DAB顯色棕色者為陽性細(xì)胞),GFAP染色為陰性,對(duì)照組染色均為陰性。從而進(jìn)一步說明誘導(dǎo)分化所得的細(xì)胞為神經(jīng)元,而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞。

2.2.3 神經(jīng)樣細(xì)胞的定量分析 經(jīng)過定量計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)用上述方法定向誘導(dǎo)MSCs后出現(xiàn)NSE陽性的細(xì)胞約為(79.5±3.2)%,Nestin陽性的細(xì)胞約為(73.8±2.6)%。說明用上述定向誘導(dǎo)分化方法可獲得比例較高的神經(jīng)元樣細(xì)胞。

圖1 預(yù)誘導(dǎo)24 h:胞體收縮,邊緣不規(guī)整,類似于球形(100×)

圖2 誘導(dǎo)2 h:胞體變成圓形或錐形,折光性增強(qiáng),突起延長(zhǎng)(100×)

圖3 誘導(dǎo)5 h:細(xì)胞形成雙極或多極結(jié)構(gòu),類似于樹突結(jié)構(gòu)(100×)

圖4 誘導(dǎo)24 h:典型的神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu),有較多的長(zhǎng)突起,突起末端形成長(zhǎng)錐樣的膨大及絲狀偽足,相互延伸形成網(wǎng)狀(100×)

3 討論

德國(guó)病理學(xué)家Cohnheim首先提出在骨髓基質(zhì)中存在有向非造血系統(tǒng)多向分化的干細(xì)胞[3]。1968年Friedenstein等首先證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓組織中的存在。近年來,MSCs的多向分化潛能[4,5]越來越受到研究者的關(guān)注,因其具有取材方便安全、來源豐富、損傷小,易于體外培養(yǎng)擴(kuò)增,在體外可長(zhǎng)時(shí)間保持未分化狀態(tài),體外基因轉(zhuǎn)染率高,并能穩(wěn)定高效表達(dá)多種治療性外源基因,而且自體獲取的MSCs回植后不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[6,7],骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)成為重要的組織工程種子細(xì)胞,因此隨著組織細(xì)胞工程學(xué)和基因工程學(xué)的興起,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞必將為神經(jīng)組織修復(fù)、骨缺損、創(chuàng)傷愈合等的治療開辟?gòu)V闊前景[8]。

體外獲得的MSCs為各種細(xì)胞的混合體,至今尚未形成一套理想的分離純化MSCs的方法。目前用于分離MSCs常用的方法主要有3種[9,10],即貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀分離法和密度梯度離心法。本實(shí)驗(yàn)采用了密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合的方法,在取出兔的骨髓細(xì)胞后,用比重為1.073的Percoll密度梯度分離液分離骨髓細(xì)胞,經(jīng)梯度離心后,由于比重差別能有效地將絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板除去,獲得純度較高的單個(gè)核細(xì)胞,然后根據(jù)MSCs與血細(xì)胞貼壁性能差異,經(jīng)體外貼壁培養(yǎng),隨換液棄除懸浮生長(zhǎng)的血細(xì)胞。原代培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞主要是MSCs,也可能混有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,利用它們?cè)谂囵B(yǎng)瓶壁的貼壁性不同,每次傳代用0.25%胰蛋白酶消化3-5分鐘,MSCs迅速?gòu)呐囵B(yǎng)瓶上脫落,而淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞由于貼附性強(qiáng)仍附于培養(yǎng)瓶壁,嚴(yán)格掌握消化酶的量和消化時(shí)間,保證MSCs在短的作用時(shí)間內(nèi)與培養(yǎng)瓶壁分開,從而使MSCs得到進(jìn)一步純化[11]。

原代培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞約24-48小時(shí)貼壁,細(xì)胞初為淋巴細(xì)胞樣小圓細(xì)胞,24-48小時(shí)后貼壁細(xì)胞明顯增多,并開始分裂增殖,圓形細(xì)胞變形伸出偽足。約8-10天可鋪滿培養(yǎng)瓶壁,細(xì)胞逐漸融合成單層。此時(shí)細(xì)胞為圓形、多角形、梭形或不規(guī)則形,呈集落狀生長(zhǎng),并出現(xiàn)核分裂相。不傳代細(xì)胞,可以持續(xù)生長(zhǎng),細(xì)胞常圍繞集落中央呈島狀分布,呈多角形并可重疊生長(zhǎng),并分泌大量基質(zhì)。傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種后24小時(shí)貼壁,逐漸伸展為梭形、紡錘形、多角形,胞體較原代略膨大,3-5天即可長(zhǎng)滿。連續(xù)傳代后,隨著傳代次數(shù)增多,細(xì)胞變?yōu)樾螒B(tài)更均一、排列更有序的成纖維細(xì)胞樣。向神經(jīng)元方向誘導(dǎo)中,bFGF作為預(yù)誘導(dǎo)劑可能參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的啟動(dòng),纖維生長(zhǎng)因子家族成員在胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞中起重要作用,而且bFGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖也有作用。正式誘導(dǎo)時(shí)加入的BHA、DMSO均為強(qiáng)抗氧化劑,其對(duì)骨髓MCSs定向誘導(dǎo)作用與其能將細(xì)胞從氧化狀態(tài)中釋放出來有關(guān)[12]。成神經(jīng)元誘導(dǎo)24小時(shí)后,多數(shù)MSCs變?yōu)榈湫偷纳窠?jīng)元樣細(xì)胞,其胞體向胞核收縮成錐形且變得致密而有折光性,有較多的長(zhǎng)突起,有些長(zhǎng)突起末端形成長(zhǎng)錐樣的膨大及絲狀偽足。免疫組化鑒定顯示神經(jīng)元特異性標(biāo)志NSE、神經(jīng)巢蛋白Nestin染色陽性。說明MSCs具有體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化潛能,為今后開展神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)受損神經(jīng)組織奠定了基礎(chǔ)。

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neuron cell formation of mesenchymal stem cells of rats by induction differentiation and immunohistochemistry identification

YU Yin,ZHAOXing-li,TIAN Yu,et al.(Department of Neurosurgery,China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun130033,China)

ObjectiveTo establish method of isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro and to induce it differentiate to neuro cell.MethodsMSCswere isolated from the femurs and tibias bones and purified and cultured in vitro,MSCs',quality was evaluated with morphology.States ofMSCsgrowing in culture were observedwith invertedmicroscope.MSCs were induced to neuro cell by LG-DMEM including 10 ng/ml bFGF and DMEM including 200μ mol/L BHA 、2%DMSO.They are identified by immunohistochemistry.ResultsThe morphous of MCSswas fusiform shape and fibroblast cell-shape after cultivation of primary and subcultured.Typical neuron cell appear after 24 hours nerve cell induction,NSE and Nestin are expressed positively by immunohistochemistry staining.ConclusionThe method of isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro is ideal and MCSs have the potency of neuron cell differentiation.

Bone marrow;Mesenchymal stem cells;Induction;Rat;Differentiation

R329.2+8

A

1007-4287(2010)07-0991-03

吉林省科委資助課題(20030536-2)

*通訊作者

2009-03-12)