靜安口服液對(duì)小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥模型大鼠抽動(dòng)行為及腦組織、血漿5-羥色胺含量的影響

隆紅艷，張 驃，談瑄忠

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210046;2.南京市中醫(yī)院，江蘇南京 210001)

小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥是一種兒童期起病、通常伴有運(yùn)動(dòng)和行為異常的慢性神經(jīng)精神障礙性疾病。1885年法國(guó)醫(yī)生Gille de la tourette首先報(bào)道了9例具有本病臨床特征的患兒，本病又稱為Tourette綜合征(Tourette Syndrome，TS)［1］。最新流行病學(xué)研究資料表明，本病的發(fā)病率在1.0% ～4%之間，且有逐年增高的趨勢(shì)，發(fā)病年齡高峰在4歲～12歲之間，男女性別比為3～4∶1。本病是一個(gè)具有復(fù)雜病因和多樣表型的臨床綜合征，其病因和發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚，一般認(rèn)為發(fā)病與遺傳和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的異常有關(guān)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)中扮演著非常重要的角色，5-羥色胺(5-HT)是僅次于多巴胺的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種生理功能，并與情緒和沖動(dòng)控制等密切相關(guān)，因此近年來(lái)有關(guān)Tourette綜合征的研究，5-HT也是研究熱點(diǎn)之一［2］。

靜安口服液具有滋腎平肝、息風(fēng)化痰功效［3、4］，6年來(lái)經(jīng)治200余例患者，已獲得較為顯著的療效。本實(shí)驗(yàn)將觀察其對(duì)Tourette綜合征模型大鼠抽動(dòng)行為的改善、腦組織及血漿5-HT含量的影響及其相互關(guān)系，以期進(jìn)一步闡明Tourette綜合征的發(fā)病機(jī)制及靜安口服液的效應(yīng)機(jī)理。

1 材料

1.1 藥品與試劑

靜安口服液由南京市中醫(yī)院制劑室提供，每毫升含生藥 1.1g，批號(hào) 081024。DOI［選擇性 5-HT(2A/2C)受體激動(dòng)劑 1-(2，5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane］由 Sigma公司生產(chǎn)，上海博蘊(yùn)生物公司提供。硫必利片由江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20070502。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相儀(HPLC):日本島津L-ECD-6A型;臺(tái)式冰凍離心機(jī):美國(guó)BECKMAN公司GS-15R型。

2 方法

2.1 TS大鼠模型及測(cè)試方法的建立、靜安口服液對(duì)抽動(dòng)行為的影響［5、6］

雄性SD大鼠40只，200g±10g，分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，隨機(jī)分為空白組、模型組、靜安組、硫必利組。模型組、靜安組、硫必利組腹腔注射1mg/(kg·d)的DOI，誘導(dǎo)大鼠抽動(dòng)模型，空白組腹腔注射相同劑量的生理鹽水。靜安組、硫必利組同時(shí)分別灌服靜安口服液、硫必利，空白組、模型組灌服同劑量生理鹽水。用藥后大鼠抽動(dòng)行為可持續(xù)2h～3h，連續(xù)給藥10d左右，大鼠產(chǎn)生較持久的抽動(dòng)行為。

大鼠腹腔注射1mg/(kg·d)的DOI后出現(xiàn)頭部抽動(dòng)、聳肩及口腔運(yùn)動(dòng)、理毛、舔食前爪等刻板動(dòng)作，其中頭部抽動(dòng)明顯且容易分辨，作為該模型誘導(dǎo)成功的觀察指標(biāo)。

大鼠的抽動(dòng)及刻板運(yùn)動(dòng)測(cè)試:治療20d后將各組大鼠逐個(gè)放入觀察籠內(nèi)，適應(yīng)5min后，按文獻(xiàn)［1］TS動(dòng)物模型中對(duì)抽動(dòng)、刻板行為的評(píng)分方法并加以改良，在最后1次給藥后1h，進(jìn)行雙盲觀察1h，5min記錄1次，并記錄總分。大鼠的抽動(dòng)及刻板運(yùn)動(dòng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分:無(wú)抽動(dòng)或刻板運(yùn)動(dòng);1分:聳肩及口腔運(yùn)動(dòng)、理毛、舔食前爪等刻板動(dòng)作或旋轉(zhuǎn)行為;2分:頭和頸部上下運(yùn)動(dòng)過(guò)多;3分:頭、頸部上下運(yùn)動(dòng)過(guò)多加旋轉(zhuǎn)行為;4分:頭向側(cè)擺合并頭和頸部的上下運(yùn)動(dòng)過(guò)多。

2.2 5-HT的測(cè)定

2.2.1 樣本采集 腦組織:第20天灌胃、腹腔注射后，夜間禁食不禁水，第21天各組大鼠脫頸處死，冰碟上迅速取出腦組織，稱重后放入－80℃冰箱保存。血漿:第20天灌胃、腹腔注射后，夜間禁食不禁水，第21天眼眶取血4ml～5ml，分別入EDTA抗凝管，冷凍離心(3000r/min，10min)，取血漿上清液－80℃冰箱保存。

2.2.2 樣本處理與測(cè)試 腦組織樣本處理:取大鼠腦組織0.7g，加入0.5 ml 10%HClO4溶液勻漿沉淀蛋白，轉(zhuǎn)移至5 ml的具塞試管中，用三蒸水定容至刻度。取上述樣品液1ml 12000r/min離心15min，取上清液490μl于PE 管中，加入10μl 10μg/ml內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋30s，20μl注入色譜分析儀分析。血漿樣本處理:取300μl大鼠血，加入50μl 30% 三氯乙酸，混勻沉淀蛋白，12000r/min離心10min，取上清液100μl于PE管中，20μl注入色譜分析儀分析。色譜條件:流動(dòng)相為檸檬酸:35mmol/L，磷酸二氫鈉:45mmol/L，庚烷磺酸鈉:2mmol/L，EDTA:0.25mmol/L，乙腈:5.5%(v/v)，NaOH 調(diào) pH=4.15;流速為1.0ml/min;柱溫為30℃;色譜柱為Diamonsi C18(150×4.6mm，5μm)不銹鋼柱。

3 結(jié)果

與空白組相比，模型組抽動(dòng)及刻板運(yùn)動(dòng)顯著性增多(P<0.01)，靜安組與硫必利組較模型組的抽動(dòng)及刻板動(dòng)作明顯減少(P<0.05)，提示應(yīng)用DOI成功誘導(dǎo)了大鼠抽動(dòng)模型，類似Tourette綜合征的臨床表現(xiàn)，表明靜安口服液明顯減少抽動(dòng)和刻板動(dòng)作次數(shù)，具有良好的對(duì)抗抽動(dòng)及刻板行為作用。

表1 靜安口服液對(duì)TS模型大鼠抽動(dòng)或刻板運(yùn)動(dòng)評(píng)分的影響(n=10，±s)

表1 靜安口服液對(duì)TS模型大鼠抽動(dòng)或刻板運(yùn)動(dòng)評(píng)分的影響(n=10，±s)

注:與空白組比較:**P<0.01;與模型組比較:△P<0.05

組別 劑量(g/100g)抽動(dòng)及刻板運(yùn)動(dòng)空 白 組 —6.70±3.65模 型 組 — 18.20±2.97 靜 安 組 1.1 12.30 ±3.62△硫 必 利 組 0.0025 14.80±3.08△

模型組大鼠腦組織中5-HT含量較空白組明顯升高(P<0.01)，治療組(靜安組與硫必利組)腦5-HT含量較模型組明顯降低(P<0.01)，靜安組與硫必利組有顯著性差異(P<0.01)，說(shuō)明抽動(dòng)癥模型建立成功;靜安口服液和硫必利可能通過(guò)降低腦組織5-HT含量，從而發(fā)揮治療TS的作用;靜安口服液比硫必利更好地降低了腦組織中5-HT的含量。

表2 靜安口服液對(duì)TS模型大鼠腦組織5-HT的影響(n=10，±s)

表2 靜安口服液對(duì)TS模型大鼠腦組織5-HT的影響(n=10，±s)

注:與模型組比較:△△P<0.01;與硫必利組比較:##P<0.01

組別 劑量(g/100g) 5-HT(ng/g)空 白 組 — 315.73±95.48△△模 型 組 — 815.12±141.60靜 安 組 1.1 320.95± 60.58△△##硫 必 利 組 0.0025 503.92±66.41△△

與空白組相比，模型組血漿5－HT水平無(wú)明顯變化;治療組(靜安組和硫必利組)血漿5-HT水平較模型組顯著降低(P<0.05)，靜安組和硫必利組相比無(wú)顯著性差異，提示靜安口服液具有良好的降低血漿5-HT含量的作用。

表3 靜安口服液對(duì)TS模型大鼠血漿5-HT的影響(n=10，±s)

表3 靜安口服液對(duì)TS模型大鼠血漿5-HT的影響(n=10，±s)

注:與模型組比較:△P<0.05

組別 劑量(g/100g) 5-HT(ng/ml)空 白 組 —197.17±104.23模 型 組 — 259.20±129.71靜 安 組 1.1 128.71±66.93△硫 必 利 組 0.0025 121.16±48.69△

4 討論

中樞5-HT神經(jīng)纖維從中縫核發(fā)出，廣泛投射到腦內(nèi)的各個(gè)區(qū)域，如大腦皮質(zhì)、紋狀體、黑質(zhì)和海馬等，是僅次于多巴胺的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，它通過(guò)釋放神經(jīng)遞質(zhì)5-HT與神經(jīng)細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，5-HT能神經(jīng)元對(duì)不同腦區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)發(fā)揮興奮或抑制的調(diào)節(jié)作用，主要取決于與之相結(jié)合的受體類型和分布位置。5-HT受體可分為5-HT1～5-HT7七大種亞型，每一種還可以被進(jìn)一步分型，其作用極其廣泛復(fù)雜，有的亞型生理功能尚不清楚。一般而言，中樞神經(jīng)細(xì)胞受體興奮性增強(qiáng)后，可促使更多的神經(jīng)遞質(zhì)與之結(jié)合，從而使游離的神經(jīng)遞質(zhì)水平降低，如多巴胺等的代謝過(guò)程即如此。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)用選擇性5-HT(2A/2C)受體激動(dòng)劑后，模型組腦組織游離5-HT水平明顯升高。這看似矛盾的結(jié)果，可能與5-HT受體功能的復(fù)雜性有關(guān)。比如大腦皮層分布有大多數(shù)的5-HT受體亞型，激活皮層突觸前的5-HT1A或5-HT1B自身受體，可使皮層5-HT的水平明顯降低，而激活突觸后的受體是加強(qiáng)或抑制皮層神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)，則取決于突觸后受體亞型的構(gòu)成情況。Bobula等報(bào)道［7］，選擇性 5-HT(2A/2C)受體激動(dòng)劑DOI可通過(guò)降低大鼠前額皮層的神經(jīng)細(xì)胞靜息K+的電導(dǎo)性，使細(xì)胞膜去極化，從而增強(qiáng)細(xì)胞的興奮性和動(dòng)作電位的發(fā)放頻率，加強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)，使皮層5-HT的水平明顯升高。此外，很多5-HT受體亞型都有易化5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)釋放的作用。如有實(shí)驗(yàn)表明，海馬中5-HT3受體亞型對(duì)5-HT遞質(zhì)的釋放具有正反饋的作用［8、9］，關(guān)于其他部位5-HT2受體亞型是否存在此機(jī)制，尚需進(jìn)一步闡明?？傊?，本實(shí)驗(yàn)觀察到的運(yùn)用選擇性5-HT(2A/2C)受體激動(dòng)劑后腦組織游離5-HT水升高現(xiàn)象，可能與其刺激突觸后受體亞型、降低神經(jīng)細(xì)胞靜息K+的電導(dǎo)性或激活易化5-HT遞質(zhì)釋放功能等因素有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DOI(選擇性5-HT(2A/2C)受體激動(dòng)劑)成功誘導(dǎo)了大鼠抽動(dòng)模型，類似Tourette綜合征的臨床表現(xiàn)，說(shuō)明5-HT活動(dòng)異常有可能是Tourette綜合征的發(fā)病原因之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5-HT分泌過(guò)多導(dǎo)致抽動(dòng)發(fā)生，靜安口服液明顯減少抽動(dòng)和刻板動(dòng)作次數(shù)，具有良好的對(duì)抗抽動(dòng)及刻板行為作用;靜安口服液明顯降低腦組織與外周血中5-HT水平，其降低模型大鼠腦組織中5-HT的作用較硫必利明顯，降低模型大鼠血漿5-HT的作用與硫必利相當(dāng)。推測(cè)其作用機(jī)理主要是拮抗5-HT受體、抑制5-HT的異常釋放，從而降低突觸前5-HT神經(jīng)元的過(guò)度支配;另外，盡管硫必利等治療Tourette綜合征常用藥能抑制抽動(dòng)癥狀，且起效較快，但是由于其具有嗜睡、肝功能損傷、肌肉強(qiáng)直及運(yùn)動(dòng)失調(diào)等副作用，不適合長(zhǎng)期應(yīng)用。相比之下，靜安口服液具有副作用小、療效確實(shí)而持久，并同時(shí)能調(diào)節(jié)患兒身體陰陽(yáng)平衡和臟腑功能、全面改善患兒身體狀況的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因而頗具發(fā)展?jié)撡|(zhì)［4］。

有關(guān)中樞與外周5-HT含量變化相互關(guān)系的研究不多，本實(shí)驗(yàn)觀察到二者變化基本一致，即中樞與外周皆有模型組含量升高(血漿中呈增高趨勢(shì))、經(jīng)治療后其含量明顯降低且成正相關(guān)現(xiàn)象。但關(guān)于腦組織與外周血5-HT含量的變化與Tourette綜合征發(fā)生之間的關(guān)系，以及靜安口服液在此關(guān)系中的影響作用，則需進(jìn)一步深入研究。

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