張立杰,李體遠,任莉莉

(暨南大學附屬二院深圳市人民醫(yī)院婦科,廣東深圳 518020)

血小板反應(yīng)素1與子宮頸病變的相關(guān)性

張立杰,李體遠,任莉莉

(暨南大學附屬二院深圳市人民醫(yī)院婦科,廣東深圳 518020)

目的檢測血小板反應(yīng)素1(TSP-1)在正常對照、子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和子宮頸癌(CC)的表達情況,比較不同程度子宮頸病變和正常對照之間TSP-1蛋白表達差異。方法以80例不同程度子宮頸病變患者作為研究組,20例正常宮頸的婦女作為對照組。共收集CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌各20份宮頸病變組織和20例正常宮頸組織。用免疫組化及RT-PCR的方法檢測TSP-1的表達情況。結(jié)果不同程度子宮頸病變及正常對照中均可檢測到TSP-1蛋白的免疫染色。在正常子宮頸和不同程度子宮頸病變中均都可檢測到TSP-1 mRNA的表達,其表達的陽性率為100%。從正常對照組到CC組TSP-1的表達強度有逐漸降低的趨勢。CINⅠ與對照組之間TSP-1表達強度無明顯差異。但CINⅡ、CINⅢ和CC組與CINⅠ和對照組之間,前者的表達強度明顯低于后者,有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論TSP-1蛋白和mRNA表達隨子宮頸病變程度逐漸降低。提示TSP-1的表達抑制內(nèi)源性血管形成,與子宮頸病變程度相關(guān)。

血小板反應(yīng)素1;子宮預(yù)病變;宮頸癌

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0878)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是子宮頸癌前病變,分為CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期。由于子宮頸病變的發(fā)生要有新生血管提供血液,在腫瘤中新生血管的形成主要發(fā)生在腫瘤邊緣,可能與局部微環(huán)境有關(guān)。血小板反應(yīng)素-1(Thrombospondin-1,TSP-1)是一種內(nèi)源性血管形成抑制因子,對調(diào)控血管形成起重要作用。研究其在子宮頸病變中的表達及其調(diào)節(jié),對宮頸病變機制研究發(fā)病將有重要意義,并可能從抑制血管形成著手探索治療子宮頸病變新途徑。

1 實驗材料

1.1 組織標本

子宮頸病變組按宮頸病變程度:CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌各20份。對照組為行子宮切除手術(shù)且排除了子宮頸病變患者,共20份?；颊吣挲g不限,術(shù)前未接受過治療,無其它內(nèi)分泌、免疫和代謝性疾病。所有病例均經(jīng)陰道鏡活檢、子宮頸錐切手術(shù)或開腹手術(shù)獲得。所有標本均在手術(shù)切除后半個小時之內(nèi)處理。研究組年齡為37.7+3.3歲,對照組年齡為34.9+2.6歲,兩組相比無統(tǒng)計學顯著性差異。

1.2 主要抗體及試劑

鼠抗人TSP-1單克隆抗體(Santa cruz,USA),TRIzol Reagent(GIBCO/BRL,USA)Takara EX Taq DNA Polymerase(寶生物工程(大連)有限公司),cDNA first chain amplification system(Invitrogen,USA)

1.3 實驗方法

1.3.1 Western Blot檢測子宮頸病變中TSP-1蛋白表達 收集各組樣本勻漿,提取總蛋白,用聚乙二醇2000濃縮,SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜,依次以 1∶700稀釋的單克隆TSP-1抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體孵育,化學發(fā)光法檢測。

1.3.2 RT-PCR檢測TSP-1 mRNA在子宮頸病變中的表達 細胞總RNA的提取按照TRIzol產(chǎn)品說明完成。RNA稀釋成100 ng/ul左右。mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明完成。TSP-1及β-actin擴增方案為 :反應(yīng)體積 25 μ l。10×PCRBuffer(無MgCl2)2.5 μ l,2 mMdNTP 2.5 μ l,2 mM MgCl21.5 μ l,2.5 μ M βactin 引物 2 μ l,5.0 μ M 的 TSP-1 引物 2.0 μ l,Taq(5 μ/ul)0.5 μ l,cDNA 2 μ l,用去離子水補足至 25 μ l。進行PCR擴增。

1.4 統(tǒng)計學分析

本實驗采用SPSS軟件分析,TSP-1的定量結(jié)果的比較用t檢驗,P＜0.05認為有意義。

2 結(jié)果

2.1 TSP-1蛋白在子宮頸病變中的表達

Western blot檢測結(jié)果表明,不同程度子宮頸病變及正常對照中均可檢測到TSP-1蛋白的免疫染色(見圖1)。正常對照中為TSP-1強陽性,但子宮頸病變TSP-1的表達多為弱陽性,并隨病變程度染色強度減弱,在CINⅢ、CC的TSP-1染色與正常對照相比,差異有顯著性(P＜0.05)。

圖1 TSP-1的Western blot結(jié)果

2.2 RT-PCR擴增TSP-1mRNA

根據(jù)所選引物,TSP-1的擴增產(chǎn)物為492 bp的片斷。內(nèi)參對照物β-actin的擴增產(chǎn)物長度為326 bp。

2.3 TSP-1 mRNA的表達情況

RT-PCR半定量的結(jié)果表明,在正常子宮頸和不同程度子宮頸病變中均都可檢測到TSP-1 mRNA的表達(表1)。CINⅠ與對照組之間TSP-1表達強度無明顯差異。但CINⅡ、CINⅢ和CC組與CINⅠ和對照組之間,前者的表達強度明顯低于后者,有顯著性差異(P＜0.05)。

圖2 TSP-1擴增結(jié)果

表1 TSP-1mRNA在子宮頸病變中的表達

3 討論

血管形成腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移中起重要作用,盡管大量流行病學研究證實,現(xiàn)已明確人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌和CIN的發(fā)病的根本治病因素[1],但子宮頸病變的發(fā)生發(fā)展必須要有新生血管提供血液,故血管形成在子宮頸病變的發(fā)病中具有重要作用。在血管形成的過程中,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等有血管形成活性的分子固然重要,但在大多數(shù)情況下,血管形成活性分子與抑制血管形成分子之間的平衡才是決定血管主要因素[2],因此近年對血管形成抑制分子的研究也逐漸增多,其中血小板反應(yīng)素(TSP-1)倍受關(guān)注。TSP-1是一種分子量為450 KD三聚體細胞外基質(zhì)糖蛋白,多種正常細胞和腫瘤細胞均可分泌TSP-1,目前認為它是一種內(nèi)源性的血管形成抑制分子,體外和體內(nèi)實驗均表明它可抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖及腫瘤血管形成[3,4]。

宮頸癌是常見的婦科腫瘤,嚴重地威脅著女性的生命健康。子宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是子宮頸癌前病變,CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ發(fā)展為癌的危險分別是 15%、30%和45%。本研究從蛋白和核酸水平比較了不同程度子宮頸病變之間TSP-1的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),從正常組織→CINⅠ→CINⅡ→CINⅢ→子宮頸癌均有TSP-1不同程度的表達。從正常對照組到宮頸癌TSP-1的表達強度有逐漸降低的趨勢。CINⅠ與對照組之間TSP-1表達強度無明顯差異。但CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌與CINⅠ和對照組之間,前者的表達強度明顯低于后者,有顯著性差異(P＜0.05)。上述結(jié)果與TSP-1作為內(nèi)源性血管形成抑制分子的作用是一致的,說明血管形成刺激因子和抑制因子之間的動態(tài)平衡是決定血管形成的關(guān)鍵。

通過對不同程度子宮頸病變中的TSP-1mRNA的檢測,說明血管與抗血管形成在腫瘤治療中的潛在應(yīng)用價值[5-7]。如能將其成功應(yīng)用在子宮頸病變的治療中,無疑為其增加了一種有效的輔助治療方法。研究表明TSP-1在子宮頸病變的血管形成中有重要作用,因此可利用其作為治療的切入點。隨國內(nèi)外研究的深入,可能從抑制血管形成著手探索新的治療子宮頸病變的方法。

[1]Folkman J.How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue[J]?Cancer Res,1986,46:467.

[2]Mojca Globo c^nik Petrovi c^,Peter Koro?ec,Mitja Kon?ik,Local and genetic determinants of vascular endothelial growth factor expression in advanced proliferative diabetic retinopathy[J].Mol Vis.2008,14:1382.

[3]D G Binion,M F Otterson,and P Rafiee,Curcumin inhibits VEGF-mediated angiogenesis in human intestinal microvascular endothelial cells through COX-2 and MAPK inhibition[J].Gut,2008,57(11):1509.

[4]Rihong Zhai,Geoffrey Liu,Kofi AsomaningGenetic polymorphisms of VEGF,interactionswith cigarette smoking exposure and esophageal adenocarcinoma risk[J].Carcinogenesis,2008,29(12):2330.

[5]Hee-Jung Yoo,Bo-Ra Yun,Jung-Hee Kwon,et al.Genetic and expression alterations in association with the sarcomatous change of cholangiocarcinoma cells[J].Exp Mol Med,2009,41(2):102.

[6]Xiaoxiang Guan,Hui Zhao,Jiangong Niu,Polymorphisms of TGFB1 and VEGF genes and survival of patients with gastric cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2009,28(1):94.

[7]Graham W.Aberdeen,Stanley J.Wiegand,et al,Vascular Endothelial Growth Factor Mediates the Estrogen-Induced Breakdown of Tight Junctions between and Increase in Proliferation of Microvessel Endothelial Cells in the Baboon Endometrium[J].Endocrinology,2008,149(12):6076.

Correlation of angiogenesis inhibitor molecules TSP-1 with cervical lesion

ZHANGLi-jie,LI Ti-yuan,REN Li-li.(Department of Gynecology,The Second Affiliated Hospital of Jinan Unive rs ity and Shenzhen Municipal People's Hospital,Guangdong Shenzhen518020,China)

ObjectiveTo investigate the expression TSP-1 protein and vessel density normal cervix、cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer.MethodsWestern Blot and RT-PCR to detect TSP-1 expression in 80 patients who had undergone cervix biopsy,conization,and radical total hysterectomy were selected as study group,and further subdividing this group into 4 groups,20 specimens of each according to the histological grade of cervical lesion(CINⅠ-Ⅲ,cervical cancer,CC).ResultsThe results showed that there are no difference of expression rates between study group and control group,but there were significant decreases in the expressionof TSP-1mRNA.The density of TSP-1 mRNA waslower than that of the control(P＜0.05).ConclusionThe signifi-cant decrease of TSP-1 proteinand mRNA from CINⅠto CINⅢto CC showed that TSP-1 expressionwas related to the level of angeogenesis and histological grade,which suggests the role of TSP-1 as an endogenous inhibitor of angeogenesis.

TSP-1;Cervical intraepitheliae neoplasia;Cervical Camcer

R737.33

A

1007-4287(2010)06-0878-03

本文課題受廣東省深圳市科技技術(shù)計劃項目基金資助(200702057)

*通訊作者

2009-05-10)