侯,魏 磊,吳 軍,侯 巍,孫 非*

(1.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.空軍航空大學(xué)門(mén)診部,吉林 長(zhǎng)春 130022;3.解放軍208醫(yī)院461臨床部,吉林 長(zhǎng)春 130021)

核酸適配子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

(1.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.空軍航空大學(xué)門(mén)診部,吉林 長(zhǎng)春 130022;3.解放軍208醫(yī)院461臨床部,吉林 長(zhǎng)春 130021)

*通訊作者

1990年Tuerk[1]和Ellingto[2]報(bào)道了一種在體外應(yīng)用隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)篩選、擴(kuò)增特定配體的技術(shù),此種技術(shù)可以得到能與非核酸靶分子具有高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸序列,此技術(shù)稱為指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),篩選出的寡核苷酸序列稱為核酸適配子(aptamer)。由于核酸適配子與抗體類似,與靶物質(zhì)結(jié)合的特異性和親和力可甚至優(yōu)于抗體,加上其靶分子廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、易改造修飾等特點(diǎn),可在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物研發(fā)等方面得以廣泛應(yīng)用[3]而受到關(guān)注。本文對(duì)核酸適配子目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用作一綜述。

1 SELEX技術(shù)原理與特點(diǎn)

1.1 SELEX技術(shù)的原理[1]

SELEX技術(shù)篩選核酸適配子的過(guò)程主要有以下幾個(gè)步驟:①預(yù)先設(shè)計(jì)并合成寡核苷酸文庫(kù)(DNA文庫(kù)或RNA文庫(kù))。文庫(kù)中的寡核苷酸的兩端是固定序列(可依此設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的引物),中間隨機(jī)排列約25-30個(gè)寡核苷酸,所以文庫(kù)的總量可達(dá)l014-15;②文庫(kù)的篩選。將靶分子與文庫(kù)進(jìn)行混合孵育,使其能與靶物質(zhì)特異性結(jié)合,形成靶物質(zhì)-寡核苷酸復(fù)合物,后可采取濾膜法、磁珠法、毛細(xì)管電泳法或柱層析等不同的分離方法,將與靶分子結(jié)合的寡核苷酸從文庫(kù)中分離出來(lái)。靶分子的混合物,通過(guò)PCR擴(kuò)增后,再進(jìn)行重復(fù)篩選。一般篩選8-20輪左右,最后將篩選到的核酸適配子文庫(kù)進(jìn)行克隆、測(cè)序并鑒定所篩選的核酸適配子與靶分子結(jié)合的特異性和親和力。也可通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得適配子與靶分子結(jié)合的最短序列。

1.2 核酸適配子的特點(diǎn)

1.2.1 應(yīng)用范圍廣 寡核苷酸隨機(jī)庫(kù)的每個(gè)核苷酸種類都存在4種可能性(A、C、G或T),若隨機(jī)區(qū)有n個(gè)核苷酸,隨機(jī)序列有4n種可能性。30個(gè)左右的核苷酸文庫(kù)的容量能達(dá)到l014-15。單鏈寡核苷酸的一個(gè)獨(dú)特表現(xiàn)是容易形成各種形狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),空間結(jié)構(gòu)的多樣性幾乎可以與所有種類的分子發(fā)生作用。適配子可以通過(guò)氫鍵、范德華力等與靶分子相互作用而形成穩(wěn)定的復(fù)合物,有研究表明,適配子與靶分子的結(jié)合是相互誘導(dǎo)的適應(yīng)性識(shí)別,當(dāng)靶目標(biāo)存在時(shí),單鏈DNA或RNA發(fā)生適應(yīng)性折疊與靶分子相互識(shí)別[4]。目前,SELEX技術(shù)所篩選的靶分子廣泛,可包括蛋白質(zhì)、多糖、金屬離子、核酸、酶、完整的細(xì)胞、病毒顆粒、病原菌等。因此,與其他文庫(kù)篩選技術(shù)相比,SEIEX技術(shù)適應(yīng)范圍更加廣泛。

圖1 SELEX技術(shù)篩選核酸適配子的基本原理

1.2.2 高特異性和親和力:核酸適配子只識(shí)別與其互補(bǔ)的分子空間結(jié)構(gòu),能夠分辨出靶分子結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差別。與靶分子的結(jié)合解離常數(shù)(kd)可達(dá)nmol/L甚至pmol/L水平,比抗體或其他類型配基有更高的親和力和特異性,幾乎可以完全避免非特異性結(jié)合[5]。如茶堿與其他黃嘌呤類似物咖啡因、可可堿的結(jié)構(gòu)非常相似,常規(guī)的茶堿單抗與后兩者有交叉反應(yīng),而核酸適配子只特異結(jié)合茶堿,與其他兩種物質(zhì)無(wú)反應(yīng),且與茶堿的親和力比與咖啡因高10 000倍。

1.2.3 制備簡(jiǎn)單、產(chǎn)品穩(wěn)定 核酸適配子與抗體相比,分子量小(5-25 ku),制備簡(jiǎn)單、產(chǎn)生不依賴于動(dòng)物、低成本、易重復(fù)、毒性低、免疫原性低、即使針對(duì)有毒物質(zhì)也可篩選出其相應(yīng)的適配子[6]。雖然適配子易被體內(nèi)的核酸酶所降解,但各種核酸修飾方法可使適配子在體內(nèi)的半壽期大大延長(zhǎng),穩(wěn)定性增加;另外,適配子與聚乙二醇(PEG)等大分子物質(zhì)結(jié)合可大大增加它的生物利用度。這些均為適配子作為治療試劑打下了基礎(chǔ)[7]。

適配子與單克隆抗體或者其他小分子藥物的作用機(jī)理更為相似。核酸適配子的特性使它們?cè)谧鳛橹委熕幬锖驮\斷試劑某些方面甚至超越抗體[8-9]。

2 核酸適配子在疾病治療中的應(yīng)用

2.1 抗凝血作用

由于核酸適配子的作用方式是直接結(jié)合并抑制已經(jīng)存在的蛋白的活性,并且具有相對(duì)的安全性,價(jià)格適中等優(yōu)點(diǎn),正成為一種新型抗凝藥物。

凝血酶是凝血系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子,它可使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,產(chǎn)生凝血作用。核酸適配子ARC183是Archemix公司研制的已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的凝血酶抑制劑,可作為冠狀動(dòng)脈旁路移植過(guò)程中的抗凝藥物[10]。它是一個(gè)長(zhǎng)15nt的DNA分子,與凝血酶結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)為2 nmol/L,與凝血酶原的Kd為50 nmol/L。ARC183在體外有很強(qiáng)的抗凝作用,可以抑制纖維蛋白原在凝血酶作用下的激活以及凝血酶引起的血小板聚集,與肝素相比,它可以降低肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥的發(fā)生率,有效抑制凝血酶。在狗和猴的心肺分流術(shù)動(dòng)物模型中,給予0.5 mg/kg.min-1的劑量,其活化凝血時(shí)間(activated clotting time,ACT)為1 500 S。它在體內(nèi)只有約100 S的半壽期,可快速逆轉(zhuǎn)其抗凝作用,未見(jiàn)明顯的毒性作用和過(guò)度出血,顯示了臨床應(yīng)用安全性。

適配子的短半壽期對(duì)抗凝血適配子是個(gè)有利的方面,而對(duì)于其它適配子的應(yīng)用來(lái)說(shuō),如何防止被核酸酶降解是提高在體內(nèi)作用穩(wěn)定性的重要方面。已有多種修飾方法來(lái)修飾核酸適配子,其中較常見(jiàn)的是2′-氟和2′-氨基的修飾。例如:特異針對(duì)凝血因子IXa的適配子進(jìn)行了2′-氟嘧啶修飾,同時(shí)在5‘端連接膽固醇分子,使得適配子在血循環(huán)中的時(shí)間從10 min提高到1-1.5 h。在單次注射劑量為0.5 mg/kg時(shí)可使其抗凝血作用時(shí)間大于1h[11]。如何對(duì)適配子的這種長(zhǎng)時(shí)間抗凝作用進(jìn)行清除,Rusconi等[12]巧妙設(shè)計(jì)了此適配子的“解毒劑”。他們合成了17nt的針對(duì)適配子序列的反義寡核苷酸,它可通過(guò)雜交作用來(lái)抑制適配子的功能。在動(dòng)物模型中注入10 min后,此反義核酸就可中和適配子的95%的抗凝作用。

2.2 抗病毒

特異針對(duì)病毒外膜蛋白、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等的適配子均可用于抗病毒治療。人類免疫缺陷病毒(HIV)包膜糖蛋白由一個(gè)外部糖蛋白(gp120)和跨膜域(gp41)組成,并在病毒進(jìn)入到細(xì)胞中的重要作用。

Jiehua等[13-14]成功的篩選出具有雙重功能的一系列抑制gp120核酸適配子,具有比抗體更好的阻止病毒復(fù)制的作用。

丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)區(qū)(HCV NS3)蛋白是治療HCV的一個(gè)重要靶標(biāo)。Fukuda K等[15]以HCV NS3h為靶分子,從體外合成的81bp隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)中篩選得到與HCV NS3h特異結(jié)合的寡核苷酸適配子,適配子在體外對(duì)HCV NS3h的活性具有一定的抑制作用。Fukuda等[16]提純了針對(duì)NS3的RNA適配子,試驗(yàn)表明該適配子能夠抑制NS3的90%的蛋白水解酶活性,而且在體內(nèi)能夠抑制麥芽糖結(jié)合蛋白-NS3(MBP-NS3)70%的蛋白水解酶活性。最近,Jeon等[17]篩選出了能封閉流感病毒受體結(jié)合域而抑制流感病毒感染的DNA適體。

2.3 抗增殖作用

血管生成在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth fac.tor,VEGF)是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子,在大多數(shù)實(shí)體瘤和某些病理情況下升高。針對(duì)VEGF165的具有核酸酶抗性的RNA適配子可以有效阻止VEGF與人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合和VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增生?？筕EGF165的適配子可抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)。濕性老年黃斑變性是老年人失明的主要原因。VEGF165 RNA適配子可局部應(yīng)用治療濕性老年黃斑變性,臨床試驗(yàn)效果較滿意[18]。

轉(zhuǎn)錄因子E2F是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的主要因子之一。Mann[19]將E2F適配子用于抑制靜脈搭橋術(shù)后血管內(nèi)皮增生的設(shè)想。通過(guò)還原壓力介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將E2f適配子轉(zhuǎn)入將移植的靜脈,結(jié)果12個(gè)月后,應(yīng)用E2F適配子治療組的移植血管的閉塞率,狹窄率明顯較對(duì)照組低。

Farokhzad等[20]用攜帶多烯紫杉醇(docetaxe1)的海綿狀納米顆粒,其中含有輔聚物PLGA-b-PEG和對(duì)PSMA胞外部分特異的RNA適配子A10。體外實(shí)驗(yàn)中,此復(fù)合物可特異結(jié)合于前列腺癌LNCaP細(xì)胞表面表達(dá)的PSMA蛋白,顯著增加其細(xì)胞毒性。單次瘤內(nèi)注射,可使5/7的LNCaP細(xì)胞移植的裸鼠模型中的腫瘤全部消退,而且在109天內(nèi)100%存活,對(duì)照組存活57%。此研究為將核酸適配子轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞以及疾病的靶向治療提供了新的方法。

李真真[21]等建立SELEX技術(shù)篩選胃癌細(xì)胞SGC-7901適配子的方法,并初步鑒定獲得的SGC-7901細(xì)胞適配子。他們?cè)隗w外合成全長(zhǎng)88bp中間含52bp隨機(jī)序列的ssDNA文庫(kù),通過(guò)優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件,利用地高辛一抗地高辛抗體一堿性磷酸酶系統(tǒng)測(cè)定親和力,經(jīng)SELEX反復(fù)篩選獲得胃癌SGC一7901細(xì)胞的特異性適配子。成功建立了SELEX技術(shù)體外篩選胃癌細(xì)胞SGC-7901高親和性適配子的方法。

3 核酸適配子在診斷中的應(yīng)用

核酸適配子與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高特異性和敏感性,使其在臨床診斷中具有廣泛的應(yīng)用前景,應(yīng)用適配子檢測(cè)靶蛋白的研究不斷增多,基于適配子的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。

3.1 生物傳感器

生物傳感器是依賴于分子識(shí)別元件的作用來(lái)構(gòu)建的。通常,生物傳感器的識(shí)別元件主要是抗體、酶、受體和核酸等。目前已有大量的各類型生物傳感器應(yīng)用在實(shí)際工作中。但是這些傳感器均具有一定的局限性,如單抗或多抗的制備比較繁瑣、固定時(shí)活性易損失、活性保存時(shí)間有限、使用時(shí)對(duì)環(huán)境和樣品條件要求比較高。然而,通過(guò)SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸適配子具備類似抗體一樣的對(duì)靶分子高的親和力和特異性,但相比大分子的抗體,寡核苷酸適配子分子量小,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,能保證合成的精確性及易連接其它分子進(jìn)行修飾,如熒光素、生物素等。同時(shí),寡核苷酸適配子可以變性、復(fù)性且速度快,可反復(fù)使用、長(zhǎng)期保存?；诠押塑账徇m配子的這些優(yōu)點(diǎn),將適配子作為生物傳感器的識(shí)別元件,制成適配子生物傳感器(Aptasensors),具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。

3.1.1 適配子電化學(xué)生物傳感器:Ikebukuro等[22]研制出一種電流型電化學(xué)傳感器,利用兩種作用于凝血酶不同靶位的核酸適配子對(duì)凝血酶不同表位,一種用作捕捉分子,另一種用作檢測(cè)分子,以“三明治”夾心方式構(gòu)建化學(xué)生物傳感器,成功地建立起凝血酶的檢測(cè)新方法。該傳感器平臺(tái)最低可檢測(cè)出10 nmol/L的凝血酶,線性范圍40-100 nmol/L。

3.1.2 適配子壓電生物傳感器:壓電生物傳感器是利用晶體的壓電效應(yīng)原理的一類生物傳感器,Liss等[23]將IgE特異性單鏈DNA適配子固定在石英晶體金膜表面建立了適配子壓電石英生物傳感器模型,能在蛋白混合物中特異性檢測(cè)IgE,最低可檢測(cè)出0.5 nmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,適配子分子小,易于在金膜表面密集固定,比傳統(tǒng)的免疫傳感器敏感度高10倍,提高了壓電石英生物傳感器的檢測(cè)范圍,而且固定在金膜表面的適配子可耐受反復(fù)洗脫,不影響其靈敏度,有利于芯片的重復(fù)利用。

Yuan等[23]利用等離子體表面共振成像與適配子技術(shù)建立蛋白質(zhì)芯片,檢測(cè)該蛋白質(zhì)芯片上吸附的蛋白抗體凝血酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)復(fù)合物。

3.2 適配子與分子信標(biāo):分子信標(biāo)(molecular beacon)是近年發(fā)展起來(lái)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的檢測(cè)技術(shù)。Li等[24]建立的適配子分子信標(biāo)(molecular aptamer beacon,MAB)技術(shù),用于凝血酶檢測(cè),該方法可對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。Fang等[25]將針對(duì)血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)B鏈的適配子兩端分別連接熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán),可以在體液或細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測(cè)到pmol/L濃度的PDGF。最近研究人員將不同熒光淬滅分子對(duì)應(yīng)用到PDGF檢測(cè)中,取得了較好結(jié)果,為應(yīng)用適配子分子信標(biāo)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)多種靶分子打下了良好的基礎(chǔ)[26]。

3.3 生物質(zhì)譜

近年來(lái),適配子又被用于MALDI—MS(基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜)法中作為蛋白質(zhì)捕獲和分析的工具[27]。將一個(gè)與凝血酶特異結(jié)合的DNA適配子共價(jià)結(jié)合到硅化玻璃面后,可以直接用來(lái)檢測(cè)凝血酶。在和不能形成G-四聚體的亂序寡核苷酸進(jìn)行對(duì)照結(jié)合實(shí)驗(yàn)后,發(fā)現(xiàn)只有特定的適配子可以捕獲凝血酶。將5-50 pmol的凝血酶分別與適配子共孵育,結(jié)果表明最佳的檢測(cè)范圍為5-10 pmol。另外,可以使用適配子從復(fù)雜的混合體系中選擇性地捕獲凝血酶。

3.4 適配子技術(shù)在其他方面的應(yīng)用

在雙位點(diǎn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街?核酸適配子既可作為捕獲分子又可作為檢測(cè)分子,已成功應(yīng)用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、CD4分子、凝血酶等靶分子的檢測(cè)。最近研究者嘗試將適配子同時(shí)作為捕獲分子和檢測(cè)分子進(jìn)行雙位點(diǎn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)[28]。在熒光偏振分析中,適配子分子小,與小分子靶物結(jié)合后易引起構(gòu)型改變,進(jìn)一步增加偏振,在非競(jìng)爭(zhēng)性熒光偏振分析有明顯優(yōu)勢(shì)。Fang等[29]用熒光基團(tuán)標(biāo)記血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGF)的適配子,通過(guò)熒光偏振分析實(shí)時(shí)監(jiān)控適配子與PDGF的結(jié)合,可以檢測(cè)到lnmol的PDGF?；诳贵w流式細(xì)胞技術(shù)存在一定局限,抗體分子較大,不易進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)結(jié)合,與Fc受體存在非特異性結(jié)合,適配子的應(yīng)用可在一定程度解決這些問(wèn)題,提高檢測(cè)的可靠性,促進(jìn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的推廣應(yīng)用。與蛋白質(zhì)印跡原理相似,研究人員利用篩選出的針對(duì)金黃色葡萄球菌的適配子來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌[30]。

4 前景與展望

由于SELEX技術(shù)特點(diǎn)突出,因而具有良好的應(yīng)用前景。凡是涉及抗體的診斷領(lǐng)域,幾乎都可以用適配子代替,特別是可以彌補(bǔ)抗體在診斷領(lǐng)域中應(yīng)用的不足。在雙位點(diǎn)結(jié)合試驗(yàn)?zāi)Ｊ街幸延醒芯勘砻?適配子比單克隆抗體更適于難以區(qū)分的結(jié)構(gòu)類似物或交叉免疫反應(yīng)的鑒別診斷;在分子信標(biāo)模式中,一般分子信標(biāo)只能用于核酸的檢測(cè),而新建立的適配子分子信標(biāo)可以用于非核酸物質(zhì)如蛋白質(zhì)的檢測(cè)。此外,適配子在毛細(xì)管電泳、流式細(xì)胞術(shù)、熒光偏振等分析模式中都發(fā)揮著非常重要的作用;在傳感器方面,與抗體介導(dǎo)的免疫傳感器相比,適配子的特點(diǎn)是親和力高、特異性強(qiáng),靶分子范圍非常廣,且穩(wěn)定性好,可快速變性、復(fù)性,能反復(fù)使用、容易制備,便于長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸。盡管適配子在生化分析領(lǐng)域的應(yīng)用目前尚處于起步階段,相關(guān)報(bào)道也相對(duì)較少,但相信這類應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越多。展望未來(lái),適配子將在分子生物學(xué)、疾病預(yù)防、臨床診斷、新藥開(kāi)發(fā)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)、生物毒素檢測(cè)、毒理學(xué)等領(lǐng)域顯示更加廣闊的應(yīng)用前景。

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