陳海琳， 張福鵬， 周永明

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

骨髓造血微環(huán)境及中藥調(diào)控作用研究進(jìn)展

陳海琳， 張福鵬， 周永明*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

骨髓造血微環(huán)境；相關(guān)因素；中藥調(diào)控作用

骨髓造血微環(huán)境是造血干細(xì)胞賴以生存，進(jìn)行自我更新，并能產(chǎn)生大量祖細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境。它包括微血管系統(tǒng)、基質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞因子［1］?；|(zhì)干細(xì)胞也稱為間充質(zhì)干細(xì)胞，在一定條件下可向成骨細(xì)胞、造血基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分化。細(xì)胞外基質(zhì)有纖維連接蛋白、層黏蛋白和膠原蛋白等，而細(xì)胞因子則包括多種黏附分子、趨化因子等，共同協(xié)調(diào)造血干細(xì)胞的生命活動［2］。造血細(xì)胞在微環(huán)境各種因素的調(diào)控下增殖、分化、發(fā)育及成熟。再生障礙性貧血、白血病等多種血液病涉及骨髓造血微環(huán)境的改變。因此研究骨髓造血微環(huán)境，對于闡明血液系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理、改善治療方案具有重要意義。近年來國內(nèi)外學(xué)者對骨髓造血微環(huán)境的研究取得了較大進(jìn)展，中醫(yī)藥治療多種血液病具有一定的特色優(yōu)勢。本文就骨髓造血微環(huán)境及中藥調(diào)控作用的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 骨髓造血微環(huán)境的相關(guān)因素

1.1 血管內(nèi)皮生長因子 骨髓造血功能依賴于一個完整的微循環(huán)系統(tǒng)，骨髓微環(huán)境中微循環(huán)的異?？赡苡绊懺煅杉?xì)胞（hemopoietic stem cell，HSC）的增殖和分化［1］。而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是調(diào)控血管生成和造血的重要因子之一。有研究表明，VEGF基因敲除小鼠的HSC生存能力、集落形成和體內(nèi)增殖率等均明顯下降。Gerber HP［3］、Fureder［4］等報道，再生障礙性貧血（Aplastic Anemia，AA）患者骨髓微血管密度和VEGF的表達(dá)水平均明顯低于正常對照組，而經(jīng)HSC移植成功或免疫抑制治療有效者，其骨髓微血管密度和VEGF表達(dá)水平均較治療前明顯增高，并伴隨造血恢復(fù)而血清VEGF水平顯著上升。

張莉［5］等比較22例AA患者及10例正常對照者骨髓微血管密度（MVD）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)AA患者骨髓MVD明顯低于對照組，并且重型AA患者的MVD較非重型AA更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。AA患者骨髓VEGF陽性細(xì)胞百分率明顯低于對照組（P<0.01）。經(jīng)免疫抑制治療獲得療效的患者骨髓 MVD及VEGF陽性細(xì)胞百分率均較治療前明顯增加，提示促進(jìn)血管生成以及改善骨髓血液循環(huán)的藥物在免疫抑制治療的基礎(chǔ)上或可加快造血恢復(fù)。

張增利［6］使用不同劑量的γ射線全身照射C57BL/6J小鼠，分別用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附法法研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對非照射組，隨著骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)時間的延長，其VEGF在基因和蛋白水平表達(dá)都顯著升高。受到5Gy或10Gy射線照射后，VEGF隨時間變化的總趨勢與非照射組相同。照射組培養(yǎng)6 d，上清液中VEGF含量高于同時點的非照射組；而在第10天時，卻顯著低于同時點的非照射組。分析其原因是5Gy或10Gy射線先期引起骨髓基質(zhì)細(xì)胞VEGF的表達(dá)增強可能是機(jī)體的一種代償性反應(yīng)，有利于機(jī)體造血的重建。但受到照射后培養(yǎng)10 d的骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)已顯著低于非照射同時點的細(xì)胞數(shù)。

楊龍［7］等將6～8周齡雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、全身照射組、全身屏蔽照射組以及左半身照射組，以8.0 Gy60Coγ射線照射，觀察小鼠外周血白細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞計數(shù)，檢測血清SOD、MDA變化，用Western blot和免疫組織化學(xué)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察骨髓造血組織VEGF表達(dá)的改變。結(jié)果在半身照射條件下，小鼠外周血白細(xì)胞降低，未照射側(cè)骨髓有核細(xì)胞計數(shù)減少，血清MDA升高，SOD降低（與正常對照組比，P<0.01）；非照射區(qū)域骨髓造血組織VEGF表達(dá)明顯減少，VEGF陽性細(xì)胞顯著下降（與正常對照組比，P<0.01）。說明局部電離輻射作用后，可導(dǎo)致非照射區(qū)域骨髓造血組織增殖抑制，VEGF表達(dá)顯著減少，氧自由基激活可能參與了該損傷過程。

1.2 骨髓基質(zhì)細(xì)胞 骨髓基質(zhì)細(xì)胞包括骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）及一些較成熟細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等，其通過分泌某些細(xì)胞因子調(diào)控HSC的生理功能。MSCs是一類具有向中胚層、外胚層及內(nèi)胚層多種組織細(xì)胞分化能力的原始細(xì)胞。在體外、體內(nèi)均可定向分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，作為骨生成細(xì)胞的來源，MSCs是骨組織再生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。AA患兒骨髓來源的MSCs體外生長特征有別于正常兒童及胎兒骨髓來源者，培養(yǎng)早期與正常兒童及胎兒骨髓來源者有近似的增殖能力，但當(dāng)擴(kuò)增至20群體倍增值時，長期增殖能力即耗竭，而正常兒童和胎兒骨髓來源的MSCs卻可穩(wěn)定擴(kuò)增至30 群體倍增值［8］。

MSCs在造血干細(xì)胞移植中有多方面作用。它一方面促進(jìn)造血干細(xì)胞植入并促使其沿多系方向分化；另一方面可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，降低移植物抗宿主病發(fā)生率及嚴(yán)重程度［9］。

朱舜明［10］等在體外對小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增，并將第三代細(xì)胞通過尾靜脈移植到同種接受全身大劑量射線照射的小鼠體內(nèi)，測定移植后不同時期小鼠外周血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）、血紅蛋白（HGB）值，觀測各組脾集落形成單位（colony forming unit，CFU-S），探討同種異體骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對急性輻射造血損傷修復(fù)的影響。結(jié)果，經(jīng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植小鼠的 WBC、RBC、PLT、HGB在移植后15～20 d較對照組明顯增高，移植組脾細(xì)胞集落形成單位（CFU-S）明顯高于對照組（P<0.01）。實驗顯示，同種異體小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植能促進(jìn)小鼠造血干細(xì)胞在脾臟定居，增強造血干細(xì)胞形成集落的能力，并能顯著提高外周血細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)損傷后早期造血功能重建。

有報道［11］，體外進(jìn)行人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)后誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，構(gòu)建二維培養(yǎng)體系，將免疫磁珠分選的CD34+臍血干/祖細(xì)胞接種于其中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在所構(gòu)建的造血干/祖細(xì)胞（HSPC）二維培養(yǎng)體系中，骨髓MSC誘導(dǎo)成骨細(xì)胞對于臍血造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)的支持作用顯著優(yōu)于其他各組培養(yǎng)體系，尤其對長期造血干細(xì)胞（long term-HSC）體外生存有更為明顯的支持作用。

1.3 骨髓基質(zhì)細(xì)胞因子 骨髓MSCs通過產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞因子如干細(xì)胞因子（SCF）、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（a-FGF和b-FGF）、白細(xì)胞介素、胰島素樣生長因子（IGF）、β型轉(zhuǎn)化生長因子（TGF－β）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）等對造血干、祖細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育起重要的調(diào)控作用。其中SDF-1是一種趨化因子，CXCR4是它的特異性受體。CXCR4在造血細(xì)胞廣泛表達(dá)，SDF-1/CXCR4信號缺乏可抑制胸腺細(xì)胞增殖和分化，SDF-1通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，增強T淋巴祖細(xì)胞生存［12］。

黏附分子是介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸及結(jié)合的一類分子，其所介導(dǎo)的造血干、祖細(xì)胞與造血微環(huán)境中各種成分的黏附作用在造血干、祖細(xì)胞的遷移、循環(huán)以及增殖分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。造血干、祖細(xì)胞表面表達(dá)一定數(shù)量和種類的黏附分子，其相應(yīng)配體在骨髓微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等處表達(dá)。目前研究較多的與造血干、祖細(xì)胞歸巢關(guān)系密切的黏附分子主要包括以下三類：整合素家族、免疫球蛋白超家族及選擇素家族［13］。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)多種黏附分子。骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-l（ICAM-1）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-l（PECAM-1）、E-選擇素（E-selectin）等。這些黏附分子既介導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞之間的黏附，又介導(dǎo)細(xì)胞間的信息通訊。在不同發(fā)育階段，造血細(xì)胞表面表達(dá)的不同黏附分子與基質(zhì)表面相應(yīng)的配體結(jié)合傳遞發(fā)育信息，一旦造血細(xì)胞發(fā)育成熟，就失去與基質(zhì)細(xì)胞黏附的相應(yīng)黏附分子而從基質(zhì)層脫離。細(xì)胞黏附分子表達(dá)降低在慢性再生障礙性貧血的發(fā)病中發(fā)揮了一定作用，隨著病情的緩解黏附分子表達(dá)增強，糾正再生障礙性貧血患者黏附分子的異常表達(dá)，可以改善其骨髓造血功能［14］。

2 中藥對造血微環(huán)境的作用研究

中醫(yī)學(xué)研究血液及造血系統(tǒng)疾病的歷史悠久。《靈樞·經(jīng)脈》載：“人始生，先成精，精成而腦髓，骨為干，脈為營……血氣乃行。”即為前人對人體血液生理的認(rèn)知，認(rèn)為血生成始于精，血氣成行賴于腦髓、骨、脈且與骨髓關(guān)系更為密切，故有《素問·生氣論》“骨髓堅固，氣血皆從”等之論述；若先天稟賦薄弱，或又后天飲食勞倦，失于調(diào)攝，致臟腑失調(diào)，精血不足則人體氣血無法正常運行而變生諸病，故亦有《病源·虛勞侯》“虛勞之人，精髓萎竭，血氣虛弱，不能充盈肌膚，故此羸瘦也”等等深刻的論述。隨著中醫(yī)血液病研究的不斷深入，中醫(yī)藥治療造血微環(huán)境相關(guān)血液病取得了良好療效，并通過基礎(chǔ)研究和實驗研究等不斷深入闡明作用機(jī)理。

2.1 增加血管內(nèi)皮生長因子及其受體表達(dá) 骨髓微血管系統(tǒng)是造血微環(huán)境的主要組成部分。放射損傷骨髓造血功能主要表現(xiàn)在微血管系統(tǒng)損傷。因而，骨髓微血管的修復(fù)、血流的重建是骨髓造血細(xì)胞生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)及體液因子供應(yīng)的保證，是促進(jìn)造血細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞的生長發(fā)育和功能恢復(fù)的重要條件之一。陶氏等［15］用60Coγ射線輻射小鼠建立骨髓微血管放射損傷模型，即時分別腹腔注射生理鹽水或刺五加注射液及復(fù)方丹參注射液20～40 mL/kg，每日2次，連續(xù)3 d，輻射后第4天骨髓病理切片觀察發(fā)現(xiàn)模型小鼠股骨骨髓毛細(xì)動脈血管數(shù)量、面積和造血組織容量百分率明顯減少，而注射刺五加及復(fù)方丹參注射液組小鼠骨髓毛細(xì)動脈血管數(shù)量、面積和造血組織容量百分率明顯增加，同時外周血RBC、WBC和Hb升高。

采用蛋白免疫印跡（Western blot）法、免疫組化法及流式細(xì)胞術(shù)，對放射損傷小鼠骨髓MSCs中VEGF蛋白表達(dá)水平、骨髓組織中VEGF受體胎肝激酶-1（flk-1）表達(dá)變化、MSCs凋亡率及細(xì)胞周期改變進(jìn)行分析，并觀察胃飼川芎嗪連續(xù)13 d作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放射損傷后小鼠骨髓MSCs中VEGF和骨髓組織中flk-1表達(dá)均明顯低于正常水平，雖然隨時間推移表達(dá)水平可見逐漸升高，但照射后第14天仍未恢復(fù)正常；而川芎嗪組在第14天時已接近正常水平。放射損傷后MSCs停滯于G0/G1期，S期合成減少，凋亡率明顯增加，第14天時仍未恢復(fù)正常；用川芎嗪治療后，MSCs的S期合成活躍，凋亡率明顯下降，第14天時恢復(fù)更明顯，接近正常水平。骨髓切片蘇木素-伊紅（HE）染色也證實川芎嗪組小鼠造血恢復(fù)明顯較對照組快。說明川芎嗪可促進(jìn)MSCs中VEGF的表達(dá)，通過VEGF/flk-1途徑改善放射損傷小鼠骨髓微環(huán)境，是其促進(jìn)造血功能恢復(fù)的機(jī)制之一［16］。

將56只健康BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組：正常組：8只小鼠不做處理；照射組：24只小鼠經(jīng)60COγ射線6.0Gy全身照射；當(dāng)歸注射液組：24只小鼠經(jīng)60COγ射線照射后給予腹腔注射當(dāng)歸注射液2.5 g/kg·d。在照射后第3、7、14天采用免疫組化法檢測小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子及其受體Flt-1的表達(dá)，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測相應(yīng)時間的骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果當(dāng)歸注射液組照射后7、14 d后骨髓有核細(xì)胞計數(shù)、血管內(nèi)皮生長因子及其Flt-1受體表達(dá)明顯高于照射組；當(dāng)歸注射液組照射后3、7、14 d骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡率均明顯低于照射組。結(jié)果說明，當(dāng)歸注射液可能通過促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子及其受體表達(dá)，修復(fù)骨髓微環(huán)境［17］。

2.2 促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）的增殖 既往的研究表明，人參總苷對體外培養(yǎng)的骨髓造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，對骨髓造血因子具有促分泌作用。研究發(fā)現(xiàn)其對BMSC的增殖也有促進(jìn)作用。將體外培養(yǎng)的BMSC分為對照組及實驗組，實驗組加入不同濃度的人參皂苷Rg1誘導(dǎo)培養(yǎng)，對照組加入等量培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1較對照液明顯提高體外培養(yǎng)BMSC的成纖維樣集落形成單位數(shù)（P<0.05～P<0.01），尤以（5～50）×10－7mol/L組為明顯，在濃度為10－6mol/L時集落數(shù)即達(dá)高峰。在人參皂苷Rg1濃度為10－6mol/L時，其BMSC3H-TdR摻入率明顯高于對照組（P<0.05～P<0.01），隨著劑量的增加其促進(jìn)增殖作用增強。用四甲基偶氮唑鹽法測定BMSC光密度值，顯示人參皂苷Rg1對BMSC增殖作用明顯強于對照組（P<0.05～P<0.01），結(jié)果說明，人參皂苷Rg1體外培養(yǎng)對豬BMSC具有增殖作用，且具有劑量依賴性［18］。10－7和 10－8mol/L的淫羊藿苷作用48和72 h體外誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖率及分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）［19］。

應(yīng)用MTT方法檢測顯示，長春新堿（VCR）5 μg/mL培養(yǎng)14 d具有明顯抑制小鼠BMSC生長的作用，川芎嗪10、20、40 μg/mL可促進(jìn) BMSC生長且明顯干預(yù) VCR對BMSC增殖的抑制［20］。

原代培養(yǎng)BMSC，隨機(jī)分為對照組和當(dāng)歸多糖組。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖濃度分別為50 mg/L、100 mg/L時明顯促進(jìn)小鼠BMSC的增殖；BMSC達(dá)80%貼壁所需時間比對照組明顯縮短；流式細(xì)胞儀檢測顯示S期和S+G2/M期均較對照組明顯增多；而G0/G1期細(xì)胞均較對照組明顯減少；說明當(dāng)歸多糖可改變BMSC細(xì)胞周期，減少凋亡細(xì)胞數(shù)目進(jìn)而促進(jìn) BMSC 的增殖［21］。

四物湯化學(xué)成分組方合可增強人BMSC系細(xì)胞的能量代謝；使處于G0/G1期的細(xì)胞顯著少于空白組；增殖指數(shù)則顯著大于空白對照組；具有明顯促進(jìn)人BMSC系細(xì)胞增殖作用［22］。

郭平［23］等采用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法測定芍藥苷對人骨髓成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞系（normal humanbone marrow fibroblastoid stromal cell line，HFCL）細(xì)胞周期及蛋白質(zhì)表達(dá)影響發(fā)現(xiàn)，芍藥苷能促進(jìn)HFCL由G0/G1期進(jìn)入S期，能促進(jìn)HFCL增殖，作用于HFCL多個靶點，促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的合成和蛋白質(zhì)分子伴侶的表達(dá)，促進(jìn)HFCL的能量代謝，抑制HFCL凋亡，間接發(fā)揮補血作用。

CFU-F源于BMSC中的成纖維細(xì)胞，而成纖維細(xì)胞是分泌造血生長因子的主要基質(zhì)細(xì)胞成分，CFU-F的數(shù)量可間接反映體內(nèi)造血的微環(huán)境。實驗顯示小鼠受到2.0 Gy X射線照射后，CFU-F的數(shù)量明顯減少，造血微環(huán)境受到損傷，預(yù)防灌胃給予松茸多糖400～1 200 mg/kg，每天1次，連續(xù)7 d的小鼠與模型對照鼠比較，CFU-F數(shù)量明顯增加，提示對成纖維細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，可促進(jìn)造血微環(huán)境的恢復(fù)且隨著劑量的增加，保護(hù)作用更強［24］。

人參多糖和當(dāng)歸多糖可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株造血生長因子的活性及粒單系集落刺激因子（GM-CSF）、IL-3和IL-6在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，能上調(diào)造血微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞分泌造血生長因子來調(diào)節(jié)血細(xì)胞的生成［25］。

2.3 調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平 吳寧［26］等取健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組：正常組（不做處理），骨髓移植（BMT）+生理鹽水組（簡稱生理鹽水組）和BMT+川芎嗪治療組（簡稱川芎嗪組）。生理鹽水組和川芎嗪組分別胃飼生理鹽水0.2 mL/只和川芎嗪每次2 mg/只，2次/d。在BMT后第7、14、21、28天處死小鼠，用 RT-PCR 和 Western blot方法檢測BMSCbFGF mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，BMT后第7、14、21天川芎嗪組和生理鹽水組 BMSC bFGF mRNA及其蛋白的表達(dá)均明顯低于正常組（P<0.01或P<0.05），但川芎嗪組明顯高于生理鹽水組（P<0.01或P<0.05），到第28天，川芎嗪組bFGF mRNA及其蛋白的表達(dá)已恢復(fù)正常，而生理鹽水組仍未恢復(fù)正常，兩組之間有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果表明，川芎嗪可能通過增加bFGF的表達(dá)水平而促進(jìn)骨髓微環(huán)境的修復(fù)，加速BMT后骨髓的造血重建。

急性放射損傷小鼠骨髓組織中成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表達(dá)顯著低于正常組（P<0.05或P<0.01），胃飼生理鹽水或川芎嗪13 d。川芎嗪組bFGF、bFGFR（bFGF受體）的表達(dá)均顯著高于對照組（P<0.05或P<0.01）。川芎嗪可促進(jìn)急性放射損傷后骨髓造血而促進(jìn)骨髓組織中bFGF、骨髓單個核細(xì)胞表面bFGFR的表達(dá)可能是其加速骨髓造血微環(huán)境的修復(fù)、重建機(jī)制之一［27］。

臨床對造血調(diào)控因子表達(dá)測定發(fā)現(xiàn)，慢性再生障礙性貧血患者骨髓造血細(xì)胞調(diào)控干細(xì)胞因子、IL-3表達(dá)水平明顯低于健康人組（P<0.01），采用補腎益髓中藥治療后升高（P<0.05）；患者治療前TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平明顯高于健康人組（P<0.01），治療后降低（治療組P<0.01，對照組P<0.05）。提示補腎益髓法中藥可調(diào)節(jié)造血相關(guān)細(xì)胞因子，增強正調(diào)控因子的作用，解除過高的負(fù)調(diào)控因子對造血細(xì)胞的過度抑制而達(dá)到治療目的［28］。

小鼠經(jīng)2.0 Gy60Coγ照射后第3天，腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg連續(xù)3 d，可制備骨髓抑制模型。與正常組比較，模型組骨髓有核細(xì)胞對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附能力顯著下降，BMSC對層黏連蛋白（LN）、纖維黏連蛋白（FN）、焦點黏附激酶（FAK）表達(dá)量明顯減少。給予四物湯配方顆粒2.5、5.0和10.0 g/kg藥液，共給藥7 d，明顯促進(jìn)LN、FN、FAK表達(dá)，并具有劑量依賴性。LN是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中非膠原性糖蛋白，是基底膜的主要活性成分；FN是骨髓間質(zhì)的重要組成成分，通過與細(xì)胞表面受體整合素結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用；FAK是一個胞漿酪氨酸激酶，在整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵作用，介導(dǎo)細(xì)胞在ECM上的黏附和遷移。四物湯配方顆粒可通過對骨髓抑制小鼠造血微環(huán)境的改善，促進(jìn)骨髓造血功能的恢復(fù)［29］。

已如前述，造血微環(huán)境對于骨髓干細(xì)胞的增殖和分化起著重要調(diào)控作用，BMSC是構(gòu)成骨髓微環(huán)境的重要組成部分，基質(zhì)為造血細(xì)胞提供一個定居、增殖、分化和發(fā)育的微環(huán)境。在造血干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和髓竇內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有一系列黏附分子受體或配體。它們介導(dǎo)造血干/祖細(xì)胞與骨髓微環(huán)境密切接觸和信息傳遞。黏附分子受體或配體之間的相互作用介導(dǎo)造血微環(huán)境對造血的調(diào)節(jié)，也影響著造血干細(xì)胞動員和歸巢，對造血細(xì)胞的增殖、分化和自我維持發(fā)揮至關(guān)重要作用。ICR小鼠經(jīng)60Coγ射線（3Gy，劑量率0.6，照射時間5 min，距離4 m）全身照射后，于第4～6天腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg和氯霉素62.5 mg/kg。正常對照組施行假照射（鉛磚屏蔽），于第4～6天腹腔注射等體積生理鹽水，以外周血象、骨髓象驗證再障模型的建立。造模動物成模后分組，小鼠分別胃飼生理鹽水、補腎化痰活血復(fù)方（熟地、何首烏、菟絲子、補骨脂、海浮石、山慈姑、五倍子、枳實、丹參、當(dāng)歸、赤芍、三七）28.6 g/kg·d，每日1次，連續(xù)喂養(yǎng)14 d后，采集骨髓進(jìn)行BMSC培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測BMSC黏附分子表達(dá)水平。結(jié)果表明，模型組小鼠BMSC黏附分子CD106、CD44、CD31表達(dá)水平均低于正常對照組，補腎化痰活血復(fù)方治療后小鼠BMSC黏附分子CD106、CD44、CD31表達(dá)水平均明顯提高，差異均有顯著性。結(jié)果提示補腎化痰活血復(fù)方可能通過提高再障小鼠BMSC黏附分子CD106、CD31、CD44表達(dá)水平，從而增強造血細(xì)胞黏附定位于發(fā)育的骨髓微環(huán)境，改善骨髓造血功能［30］。

VCAM-1是一種重要的細(xì)胞黏附分子，主要表達(dá)于BMSC、活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞等，在調(diào)節(jié)骨髓造血中有重要作用。有研究表明，在VCAM-1的啟動子區(qū)域含NF-кB的結(jié)合位點，故VCAM-1的基因表達(dá)主要由 NF-кB控制。NF-кB是一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與造血生長因子如IL-6、GM-CSF、CAM轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，具有十分重要的功能。用P388瘤株制作荷瘤小鼠，并腹腔注射環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷獲得小鼠骨髓抑制模型，模型組給予生理鹽水，藥物組灌胃給予補虛化瘀方（由熟地黃、黃芪、女貞子、雞血藤等藥物組成）20 g/kg，每日1次，連續(xù)用藥12 d。取股骨骨髓分別進(jìn)行骨髓血管細(xì)胞黏附分子-l（VCAM-1）和核轉(zhuǎn)錄因子（NF-кB）定量測試和分析，發(fā)現(xiàn)模型組VCAM-1骨髓血竇的內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)很少；補虛化瘀方組表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞的VCAM-1明顯增加，與模型組比較有顯著差異，NF-кB的表達(dá)明顯高于模型對照，同時用藥組動物骨髓有核細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的骨髓成纖維細(xì)胞集落形成單位（CFU-F）計數(shù)也明顯多于模型對照組。說明補虛化瘀方可刺激BMSC的增殖，保護(hù)BMSC免于化療藥物的損傷［31］。

基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞的直接連接有傳遞轉(zhuǎn)換信息分子的作用，此種連接是通過基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞表面的黏附分子實現(xiàn)的，在眾多的干細(xì)胞表面黏附分子中，CD49d是介導(dǎo)干細(xì)胞與骨髓黏附的最重要受體，它通過與VCAM-1、纖維連接蛋白（Fn）的結(jié)合介導(dǎo)干細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的黏附，直接參與紅系、B淋巴系的分化，并有利于骨髓造血細(xì)胞的增殖，90%以上的CD34+細(xì)胞都表達(dá)CD49d。VCAM-1表達(dá)于骨髓微環(huán)境網(wǎng)狀纖維細(xì)胞和骨髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞上。VCAM-1在調(diào)節(jié)造血中有重要作用，參與造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞形成聚集體，有利于造血細(xì)胞增殖、分化。丹參素300 mg/kg、川芎嗪50 mg/kg腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d?？娠@著增強小鼠骨髓造血細(xì)胞CD49d的表達(dá)，同時增加基質(zhì)細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)，說明丹參素和川芎嗪有可能通過作用于造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，提高黏附分子受體和黏附分子配體表達(dá)，從而加強基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞相互作用，促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞的增生，參與造血干細(xì)胞的動員過程［32］。

造血干細(xì)胞的歸巢是指造血干細(xì)胞通過靜脈移植經(jīng)外周血循環(huán)進(jìn)入受體后在骨髓內(nèi)的識別和定位。移植后造血干細(xì)胞是否能回到并“定居”于骨髓，是其能否繼續(xù)增殖分化、重建造血的關(guān)鍵。造血干細(xì)胞歸巢的確切機(jī)制尚不十分明確，這一過程首先與骨髓血竇內(nèi)皮表達(dá)的選擇素滾動黏附有關(guān)，然后在血流切應(yīng)力的作用下，由干/祖細(xì)胞所表達(dá)的整合素分子與血管內(nèi)皮上的VCAM-1、細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）相互作用介導(dǎo)，牢固黏附于血管內(nèi)皮孔上，并穿越內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入造血組織，最終到達(dá)血管外骨髓微環(huán)境并開始重建造血。Balb/c小鼠全身均勻接受劑量為9.0Gy60Co照射，照射后6 h內(nèi)尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞8×106個/0.5 mL，然后分為兩組，一組給予參附湯，從移植后1 d開始用藥連續(xù)14 d；對照組給予同容量0.9%生理鹽水。移植后3、7、14 d激光共聚焦顯微鏡檢測顯示，參附組小鼠造血干細(xì)胞歸巢的數(shù)量較對照組增多，并隨移植時間的推移，呈逐漸增多的趨勢。流式細(xì)胞儀檢測顯示，骨髓單個核細(xì)胞的sca-1細(xì)胞表達(dá)率與空白組相比明顯最多，兩者間有顯著性差異（P<0.05）。說明參附湯能促進(jìn)自體移植小鼠造血干細(xì)胞的歸巢［33］。

3 小結(jié)與展望

越來越多的研究表明，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已將改善造血微環(huán)境作為促進(jìn)造血機(jī)能修復(fù)的一個新途徑。因此觀察受試藥物是否具有改善造血微環(huán)境的作用也為鑒別和發(fā)掘有效改善造血機(jī)能中藥及復(fù)方提供了良好依據(jù)。近年來骨髓造血微環(huán)境及中藥對其影響的研究已有較大進(jìn)展。但這一領(lǐng)域的研究尚有許多問題亟待深入研究或探討解決。目前的研究方法大多為體外間接研究或整體動物試驗時僅對造血微環(huán)境中某方面指標(biāo)進(jìn)行觀察。中藥對各種細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，以及各種信號的相互關(guān)聯(lián)較少涉及，不能綜合反映對造血干/祖細(xì)胞與微環(huán)境的作用機(jī)制。

如何闡明藥物對特定造血微環(huán)境的作用也有待加強。現(xiàn)已報道的一些有效中藥或復(fù)方，所用劑量普遍偏大，如按實驗動物和人體表面積等效計算，有些會因臨床需用量過大而難以實施。因此，尋找、發(fā)掘活性更強的中藥及復(fù)方，或從已知有效中藥及復(fù)方中提取活性物質(zhì)的研究尚需深入開展。還有一些報道體外實驗顯示可改善造血微環(huán)境的藥物，如何闡明其在整體用藥時能維持一個穩(wěn)定的有效血濃度，并能擴(kuò)散或轉(zhuǎn)運至造血微環(huán)境而發(fā)揮作用也是需要繼續(xù)探索的問題。相信這些問題的深入探索和逐一解決將有助于通過改善造血微環(huán)境而進(jìn)一步發(fā)揮中藥改善造血細(xì)胞造血功能的作用，為中醫(yī)藥治療血液病提供更為堅實的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論支撐。

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1001-1528（2010）07-1183-06

2010-01-17

陳海琳（1983－），女，住院醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合血液病臨床及科研工作。Tel：13651784266 E-mail：chenhlyy@yahoo.cn

*通訊作者：周永明，教授、主任醫(yī)師。Tel：（021）65161782-3225 E-mail yongmingz@sohu.com