金 云，江 情，李智華，羅云鵬，陶 麗，占 萍

(江西省皮膚病專科醫(yī)院，江西 南昌 330001)

API 20C AUX系統(tǒng)和科瑪嘉酵母菌顯色培養(yǎng)基為臨床常用的酵母菌鑒定方法，為比較這兩種方法的優(yōu)缺點，并了解我院門診患者皮膚粘膜的酵母菌菌種構(gòu)成，我們對我院2008年6月至2009年5月分離的138株酵母菌分別用API 20C AUX生化系統(tǒng)和科瑪嘉酵母菌顯色培養(yǎng)基兩種方法進行鑒定，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 共收集酵母菌138株，分離自我院門診患者的皮屑、甲屑、粘膜 (口腔和生殖器部位)。

1.2 菌株活化、增殖和鑒定 將初代菌挑取單菌落在SDA平皿上劃線分離純化，培養(yǎng)24～48h新鮮的菌落分別用API 20 C AUX生化鑒定系統(tǒng) (法國梅里埃生物公司生產(chǎn))和科瑪嘉酵母菌顯色培養(yǎng)基(干粉購自鄭州博賽公司，原制造商為法國CHROagar公司)進行鑒定。

1.2.1 API 20 C AUX鑒定步驟 準備一個培養(yǎng)盒，倒入約5ml蒸餾水于盤的蜂窩小凹中，造成一濕室。記錄菌株編號于盤的長邊部分。從包裝中取出試驗條，放入培養(yǎng)盒中。取一安瓿0.85%NaCl培養(yǎng)基(2ml)，挑取待鑒定菌落制成2麥氏濃度的均一菌懸液，再取100μl轉(zhuǎn)入API 20C培養(yǎng)基安瓿瓶內(nèi)，混勻。將API 20C培養(yǎng)基中菌懸液注入API C板條小杯內(nèi)。沿杯壁小心注入，不要產(chǎn)生氣泡，不要過滿(表面平或稍凸)。蓋上蓋子，27℃孵育48～72h判讀結(jié)果。采用apiwebTM軟件獲取鑒定結(jié)果。

1.2.2 科瑪嘉酵母菌顯色培養(yǎng)基鑒定步驟 所購干粉按47.7g/L比例用無菌蒸餾水溶解、加熱(不超過100℃)、充分混勻后，傾入已滅菌帶蓋的6cm培養(yǎng)皿中，每個平皿約10ml，冷卻凝固后放4℃冰箱內(nèi)備用。使用前取出培養(yǎng)基恢復(fù)至室溫，將待鑒定菌株劃線或涂布接種，25～30℃培養(yǎng)48h，依據(jù)顏色變化判斷結(jié)果。綠色、翠綠色為白假絲酵母菌，藍灰色、鐵藍色為熱帶假絲酵母菌，粉紅色(模糊有微毛菌落較大)為克柔假絲酵母菌，紫色為光滑假絲酵母菌。白色為其他酵母菌。

2 研究結(jié)果

138株菌株，來自男性81株，女性57株，年齡6月～84歲，來自皮屑109株 (79.0%)，甲屑5株(3.6%)，粘膜 23 株(16.7%)，大便 1 株(0.7%)。

通過科瑪嘉培養(yǎng)基，鑒定出白假絲酵母菌76株，熱帶假絲酵母菌2株，其他菌株難以鑒定，未發(fā)現(xiàn)克柔假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌。

通過API20AUX生化鑒定系統(tǒng)。鑒定出白假絲酵母菌76株和光滑假絲酵母菌2株，與科馬嘉培養(yǎng)基鑒定結(jié)果完全符合。另外，該方法還鑒定近平滑假絲酵母菌32株 (23.2%)，高里假絲酵母菌10株(7.2%)，無名假絲酵母菌6株(4.3%)，阿薩絲孢酵母菌4株(2.9%)，羅倫隱球菌3株(2.2%)，土生隱球菌2株(1.4%)、涎沫假絲酵母菌1株(0.7%)，粘紅假絲酵母菌1株(0.7%)，小紅假絲酵母菌1株(0.7%)。詳見表1。

表1 兩種鑒定方法的比較

圖1 近平滑假絲酵母菌在科瑪嘉上的形態(tài)：左邊為皺褶菌落，右邊為光滑菌落

在科馬嘉顯色培養(yǎng)基上，筆者發(fā)現(xiàn)一些其他類型的念珠菌也顯示顏色，如近平滑假絲酵母菌為粉紅色，顏色類似與克柔假絲酵母菌，但是菌落較小，光滑或皺褶，約1～2mm左右，周圍無微毛(見圖1)，而且有部分菌株48h內(nèi)不顯示顏色，72h后才轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，而克柔假絲酵母菌菌落較大，約4mm，周圍有微毛[1]；無名假絲酵母菌為淺藍色，類似于熱帶假絲酵母菌的顏色，但是顏色較淡，為淡藍色，無假菌絲，而熱帶假絲酵母菌菌落光滑、濕潤，顏色更深，生長成熟的菌株為紫藍色，菌絲豐富。(見圖2)。根據(jù)這些特征，大致可以區(qū)分，但準確鑒定尚需API 20C確認。

圖2 熱帶假絲酵母菌和無名假絲酵母菌的不同形態(tài)：左邊為無名假絲酵母菌，為淡藍色，右邊為熱帶假絲酵母菌，顯紫藍色。

在API鑒定系統(tǒng)中，需要注意的是，需要取純化24～48h的單菌落進行鑒定，否則無法得出正確結(jié)果。在判讀結(jié)果時，有時候?qū)φ毡矔a(chǎn)生一定濁度，所以試驗杯需要與對照杯相比較，比對照杯更濁的才為陽性反應(yīng)。

3 討論

酵母菌為人類皮膚粘膜常駐菌群，大部分為條件致病菌，一定條件下可導(dǎo)致局部和系統(tǒng)感染，其中最常見為念珠菌和馬拉色菌屬，因為馬拉色菌為嗜脂性，普通SDA培養(yǎng)基上不生長，容易區(qū)分，其他酵母則絕大部分為白色酵母樣菌落，難以判斷菌種。

近些年來，由于廣譜抗生素和免疫抑制劑的使用，以及HIV和糖尿病等免疫受損人群增多，假絲酵母菌的發(fā)病率和致死率日益增高，其他非假絲酵母菌性酵母及酵母樣真菌引起皮膚黏膜感染的報道也屢見不鮮[2-4]。另外，據(jù)報道，在假絲酵母菌中，白假絲酵母菌所占的比重逐漸下降，近平滑、熱帶、光滑和克柔的感染率在較快上升，其中部分菌種對氟康唑不敏感或天然耐藥[5-6]。因此，臨床上準確、快速鑒定菌種，指導(dǎo)醫(yī)生選擇敏感抗真菌藥物有著重要意義。

酵母菌鑒定常通過形態(tài)學、生化反應(yīng)、血清學試驗等綜合判斷，但是操作繁瑣，耗時長，存在誤差，且不能判斷混合感染，因此局限了其應(yīng)用。目前臨床常用的酵母菌鑒定方法為科瑪嘉酵母菌顯色培養(yǎng)基和API 20C AUX生化鑒定系統(tǒng)，前者成本低，操作和判讀簡單，結(jié)果較為準確，可用作快速和初步鑒定，但是能鑒定的菌種少，僅包括白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌，其他菌種無法鑒定，如本研究中比例較高的近平滑假絲酵母菌無法鑒定；另外，根據(jù)筆者經(jīng)驗，光滑和克柔假絲酵母菌在培養(yǎng)基上常顏色類似，難以判斷。法國梅里埃公司開發(fā)的API 20C AUX酵母菌生化系統(tǒng)為一種很好的鑒定酵母菌的方法，可以準確鑒定多種酵母菌，可用作金標準，該方法的不足之處是試劑和軟件成本較高，操作較為繁瑣少。在本研究中，臨床138株酵母菌，以上兩種方法均能鑒定的菌種符合率100%，說明這兩種方法有較好的一致性，但后者鑒定的菌種遠多于前者，結(jié)果更可信。因此，前者適合臨床快速、簡單鑒定常見假絲酵母菌，而后者適用范圍更廣，可用于鑒定多種酵母菌。

查閱文獻，國內(nèi)關(guān)于假絲酵母菌菌種分析的報道多為深部假絲酵母菌病，針對皮膚黏膜部位假絲酵母菌定植和致病菌種的研究缺乏，僅熊亞等在分析重慶地區(qū)淺部真菌病病原菌時對分離的小部分假絲酵母菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌最多，克柔假絲酵母菌次之[7]。在我們的研究中，近平滑假絲酵母菌為第二優(yōu)勢菌種。另外，在23份黏膜部位標本中，22份為白假絲酵母菌，僅1份為近平滑假絲酵母菌。而汕頭地區(qū)報道的1164份生殖器標本中，第二位優(yōu)勢菌為近平滑假絲酵母菌(7.46%)，光滑假絲酵母菌次之(3.39%)[8]。而重慶地區(qū)報道的118例口腔標本中，熱帶假絲酵母菌占第二位(12.7%)，其次為高里假絲酵母菌 (5.1%)[9]。這些差異可能與不同地區(qū)、標本來源、樣本量以及鑒定方法有關(guān)。

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