王麗聰，曹玉華

（1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化紡系，江蘇 江陰 214431；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214036）

黃芩藥材的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究

王麗聰1，曹玉華2

（1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化紡系，江蘇 江陰 214431；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214036）

采用毛細(xì)管電泳方法建立黃芩不同產(chǎn)地藥材的指紋圖譜。考查多種提取方法提取黃芩藥材中黃芩苷的提取率；研究運(yùn)行緩沖液的濃度和酸度、檢測(cè)波長(zhǎng)及分離電壓對(duì)黃芩藥材指紋圖譜的影響，得到了優(yōu)化的測(cè)定條件（50mmol/L硼砂緩沖液，pH值7.94，分離電壓為20kV,柱上254nm紫外檢測(cè)）。進(jìn)行精密度和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5%。最后利用相似度和聚類(lèi)分析兩種方法對(duì)10批黃芩藥材的毛細(xì)管電泳指紋圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果與實(shí)際樣品分類(lèi)相符合。

毛細(xì)管電泳；指紋圖譜；黃芩

目前，色譜法尤其是高效液相色譜法（HPLC）是中藥指紋圖譜研究最常用方法。但用HPLC進(jìn)行中藥成分分析常遇到一些問(wèn)題。如色譜柱易受污染，柱壽命短且難以再生，分析運(yùn)行成本高且費(fèi)時(shí)長(zhǎng)。毛細(xì)管電泳具有分離效率高、分析速度快、試劑用量少和成本低等優(yōu)點(diǎn)[1，2]，運(yùn)用高效毛細(xì)管電泳（HPCE）方法對(duì)黃芩藥材的指紋圖譜進(jìn)行研究，作者還未見(jiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用HPCE方法建立黃芩藥材指紋圖譜，并對(duì)10批藥材的指紋圖譜進(jìn)行了分析比較，為黃芩藥材的質(zhì)量評(píng)估提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(CAPEL 105,俄羅斯),配有紫外檢測(cè)器；超聲波振蕩器(BRANSON SB3200-T,上海)；微波爐（松下變頻）；石英毛細(xì)管(有效長(zhǎng)度: 52 cm,內(nèi)徑:50μm,Polymicro Technologies,USA)。HW-2000色譜工作站（上海千譜軟件有限公司，上海）。

所用藥材樣品山西黃芩（1#）、內(nèi)蒙黃芩（2#）、滇黃芩（家種3#）、滇黃芩（野生4#）均由洛陽(yáng)高新開(kāi)發(fā)區(qū)陸生天然植物研究所王忠東教授提供并鑒定，其余河北黃芩5-10#為市售。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 供試品溶液的制備

精確稱(chēng)取黃芩粉末試樣約0．1g，加入水10mL，微波提取40s，離心，吸取上層清夜，經(jīng)0．45μm濾膜過(guò)濾，即得黃芩樣品溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

運(yùn)行緩沖液為50mmol/L的硼砂緩沖溶液（pH= 7．94），所有溶液使用前均用0．45μm聚丙稀濾膜過(guò)濾，測(cè)定溫度20℃，分離電壓20kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，30 mb壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間10s。實(shí)驗(yàn)前，依次用0．1mol/L的NaOH、水、運(yùn)行緩沖液分別沖洗10、4、20min，兩次進(jìn)樣間用緩沖液在20kV電壓下沖洗5min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品溶液的制備

實(shí)驗(yàn)中曾采用各種提取方法，包括：不同比例醇提、水提、超聲醇提、超聲水提及微波提取。黃芩苷含量一般作為黃芩藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)。以考查各種提取方法的提取率，將提取液中黃芩苷的含量作為選擇提取方法依據(jù)之一,結(jié)果如表1所示（表中方法1～4依次表示25%，50%，75%，100%乙醇超聲波提取30min；方法5為水煎煮30min；方法6為水超聲波提取30min；方法7～10表示依次25%，50%，75%，100%乙醇回流提取30min；方法11為微波提取40s）。結(jié)果可知，微波提取40s與75%乙醇回流提取30min所得黃芩苷的提取率最高。其次,根據(jù)指紋圖譜的特性，我們考察各種提取方法所得電泳圖中峰的個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)各譜圖中峰個(gè)數(shù)依次為微波提取40s＞75%乙醇回流提取30min＞水煎煮30min＞水超聲波提取30min＞乙醇超聲波提取30min。綜合以上兩點(diǎn)的考察,我們確定微波提取40s為黃芩毛細(xì)管電泳指紋圖譜的最佳提取方法。同時(shí)，微波提取還具有簡(jiǎn)便、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。

表1 不同提取方法所得黃芩苷含量

2.2 電泳條件

由于硼砂與黃酮類(lèi)化合物發(fā)生螯合反應(yīng)可以增大被測(cè)組分的溶解度，所以選擇硼砂溶液作為緩沖液。運(yùn)行緩沖液的pH值是影響電滲流和各分離組分電泳淌度的最重要因素?？疾榱藀H值6～10范圍對(duì)電泳分離的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值大于8．5時(shí)，圖（1）中前兩個(gè)大峰均為混合峰，沒(méi)有得到分離；且pH值越高，黃酮類(lèi)物質(zhì)越易氧化，測(cè)定的重現(xiàn)性不能得到保證。當(dāng)pH值小于7．7時(shí)，圖(2)中最大的峰為混合峰，沒(méi)有得到分離。而pH值在7．7～8．2之間，各峰基本分離，見(jiàn)圖（3）。因此，選擇pH值7．94為最佳運(yùn)行緩沖液pH值。此外，還考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)（210，254，278，290nm）及不同分離電壓（15、20、25kV）的影響。從靈敏度、分離度以及電泳峰個(gè)數(shù)綜合考慮，選擇254nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，以50mmol/L硼砂（pH=7．94）為運(yùn)行緩沖液，分離電壓20kV，30mBar下壓力進(jìn)樣10s的最佳電泳條件。

2.3 指紋圖譜的建立

不同樣品按照1．3方法分別進(jìn)樣，測(cè)定，得各樣品的毛細(xì)管電泳指紋圖譜。黃芩樣品的典型電泳圖見(jiàn)圖3。

2.4 方法學(xué)考察

儀器精密度實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得共有峰11個(gè)，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜3%，共有峰相對(duì)面積的RSD＜5%，表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：取同一樣品5份，按1．2條方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜4%，共有峰相對(duì)面積的RSD＜5%，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24h進(jìn)樣，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜5%，色譜峰相對(duì)峰面積的RSD＜5%，表明供試品溶液在24h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)

2.5.1 相似度計(jì)算

采用工作站計(jì)算軟件，對(duì)10批藥材指紋圖譜進(jìn)行重疊，各批樣品相應(yīng)色譜峰大體重疊，符合匹配要求。匹配后產(chǎn)生11個(gè)共有電泳峰，以6號(hào)峰作為參照物，計(jì)算10批樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。以供試品的各峰平均值為對(duì)照模板，利用Excel 2002軟件[3]，采用夾角余弦和相關(guān)系數(shù)的方法來(lái)計(jì)算黃芩指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相似度。結(jié)果如表3和表4中第12、13行所示。

表2 樣品的CE指紋圖譜色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 樣品CE指紋圖譜色譜峰相對(duì)面積值

2.5.2 系統(tǒng)聚類(lèi)分析

各色譜峰的相對(duì)峰面積值見(jiàn)表3，以相對(duì)峰面積值為變量，利用SAS軟件中最小距離法進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果將10個(gè)樣品分為五類(lèi)，如圖4所示。

2.5.3 結(jié)果分析

相似度計(jì)算結(jié)果表明,5個(gè)產(chǎn)地黃芩藥材的指紋圖譜的圖貌基本一致,但各共有峰的相對(duì)峰面積有所不同。從表3可以看出，除了3?！?＃滇黃芩外其他樣品的指紋圖譜的相似系數(shù)均大于0．985，即滇黃芩與其他樣品間的差異較明顯，5#～10#為相同產(chǎn)地，樣品指紋圖譜的相似系數(shù)沒(méi)有明顯差異。聚類(lèi)分析樹(shù)形圖表明，10批樣品分為5類(lèi)，5#～10#為最小距離，分為一類(lèi)，而1#～4#各分為一類(lèi)，這與事實(shí)相符合。這些都表明黃芩中各成分含量的差異與其生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，不同產(chǎn)地，峰面積比值有較大差異。因此，本研究結(jié)果從一定程度上表明指紋圖譜是控制藥材內(nèi)在質(zhì)量的有效手段。

［1］ 曹玉華，汪云．毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定胡黃連中香草酸和阿魏酸的含量[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào),2003,22(6):95-97．

［2］ 劉保啟，胡孝忠，王玉春，等．高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定姜黃中姜黃素類(lèi)化合物[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào),2004，23(1):109-111．

［3］ 苗愛(ài)東，孫殿甲．Excel 2002在中藥指紋相似度計(jì)算中的應(yīng)用[J]．藥學(xué)進(jìn)展,2003,27(1):51-54

Study on the fingerprints of radix scutelariae by HPCE

WANG Li-cong1,CAO Yu-hua2
(1.Department of Chemical Engineering,Jiangyin Polytechnic College,Jiangsu Jiangyin,214431; 2.School of Chemical and Material Engineering,Southern Yangtze University,Jiangsu Wuxi 214036)

A method based on high performance capillary electrophoresis(HPCE)to establish the fingerprint of Radix Scutelariae was described.The contents of Baicalin in Radix Scutelariae extraction with various kinds of extraction methods were determined to choose appropriate extraction method.The effects of concentration and acidity of running buffer,UV detection wavelength and applied voltage were investigated.The optimum conditions were a 50mmol/L borax buffer(pH7.94)as the running buffer,separation voltage of 20kV and 254nm as detection wavelength.This proposed method demonstrated good stability and reproducibility with RSD less than 5%for both the relative retention time and the relative areas.Finally,the data of fingerprints of 10 batches of Radix Scutelariae were processed with two different mathematic methods of similitude coefficient and the SAS system,and the results of both methods were consistent with the facts.

capillary zone electrophoresis;radix scutelariae;fingerprints

book=2010,ebook=185

10.3969/j.issn.1008-1267.2010.04.009

TQ657.8

A

1008-1267（2010）04-024-04

2010-03-10

王麗聰（1979-），女，山西汾陽(yáng)人，碩士，研究方向?yàn)橹兴幏治觥?/p>