人 PTEN基因 RNA干擾及其 RESC救援慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

王玉梅1,2,3)△,盛光耀1)
1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒內(nèi)科鄭州 450052 3)美國圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液系密蘇里州 63110-1093
△女,1962年 11月生,博士研究生,主任醫(yī)師,研究方向：小兒血液病 /腫瘤學(xué),E-Mail：wangyuMei15@yahoo.com.cn

PTEN基因;慢病毒載體;RNA干擾;逃避 RNA干擾策略結(jié)構(gòu);脫靶效應(yīng)

目的： 構(gòu)建人 PTEN基因RNA干擾(RNA i)及其逃避RNA i策略結(jié)構(gòu)(RESC)救援的慢病毒載體。方法：利用 Invitrogen公司在線軟件,針對已篩選確定的 PTEN基因 RNA i有效靶序列,設(shè)計并合成靶序列的 o ligoDNA,退火形成雙鏈DNA,與經(jīng) XbaⅠ和 XhoⅠ酶切后的 pFLRu-GFP載體連接構(gòu)建成 pFLRu-U6-shPTEN慢病毒載體。在此基礎(chǔ)上,引入外源設(shè)計的 PTEN mRNA,與經(jīng) Eco RⅠ和BaMHⅠ酶切后的 pFLRu-U 6-shPTEN載體連接,從而產(chǎn)生在同一個載體內(nèi)兼有人 PTEN基因 shRNA及其救援 cDNA同時表達(dá)的 RESC慢病毒載體 pFLRu-U 6-rrshPTEN。2者均轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 XL10感受態(tài)細(xì)胞,制備質(zhì)粒并用酶切及測序鑒定。分別用 pFLRu-U 6-shPTEN、pFLRu-U 6-rrshPTEN與 pCMV-dR8.2ΔR和 pCMV-VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T包裝細(xì)胞,包裝產(chǎn)生 2種慢病毒,收集病毒上清,系列稀釋法檢測病毒懸液的滴度。結(jié)果：氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆、酶切鑒定、U 6前引物測序鑒定結(jié)果顯示p FLRu-U6-shPTEN和 p FLRu-U 6-rrshPTEN均為陽性克隆,且 2種慢病毒的滴度分別為 6.6×105和 5.6×105p fu/mL。結(jié)論：成功構(gòu)建出人 PTEN基因RNA i及其RESC慢病毒載體。有效地避免了由于脫靶效應(yīng)所引起的假陽性結(jié)果對實驗的干擾,為研究 PTEN基因功能提供了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞載體。

與張力蛋白同源的 10號染色體缺失的磷酸酶基因[1](phosphatase and tensin homo logue deleted on chromosoMe ten gene,PTEN),是具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,它的缺失和失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-3]。RNA干擾 (RNA interference, RNA i)技術(shù)可高效、特異地下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá),在基因功能研究和基因治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景,為研究內(nèi)源性基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了強有力的研究工具[4]。但是在 RNA i過程中常有“脫靶效應(yīng)”的發(fā)生,從而造成實驗假陽性結(jié)果[5-6]的出現(xiàn)。該研究旨在構(gòu)建 PTEN基因的 RNA i及其逃避 RNA i策略結(jié)構(gòu)[7](RNA i escape strategy construct,RESC)救援的慢病毒載體并進行鑒定,它有效地避免了因“脫靶效應(yīng)”所造成的假陽性結(jié)果對實驗的干擾,為 PTEN基因的功能研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料 pFLRu-GFP載體在 pB luescrip t(購自Invitrogen公司)基礎(chǔ)上,加入綠色熒光蛋白 (GFP)、Flag-H is標(biāo)簽、血細(xì)胞凝集素和嘌呤霉素內(nèi)部核糖體進入位點等構(gòu)建而成。PTEN基因的慢病毒干擾片段、所用引物,采用 Invitrogen網(wǎng)站上的免費軟件設(shè)計并由美國 Integrated DNA Techno logies( IDT)公司合成。高糖DMEM培養(yǎng)基、MEMA lpha培養(yǎng)基和胎牛血清 (FBS)購自 Gibco公司。質(zhì)粒提取試劑盒,膠回收試劑盒,PCR擴增試劑盒,Op ti-MEM培養(yǎng)基,TRANSIT,pCMV-dR8.2ΔR,pCMV-VSV-G,限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ、XhoⅠ、B aMHⅠ和 Eco RⅠ,T4DNA連接酶,胰蛋白酶均購自 Invitrogen公司。魚精蛋白購自 SigMa公司。293T細(xì)胞株購自 Invitrogen公司,由美國圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)實驗中心傳代培養(yǎng)。大腸桿菌 XL10感受態(tài)細(xì)胞由美國圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)實驗中心制備。

1.2 PTEN基因 RNA i慢病毒載體的構(gòu)建 試驗過程包括 3個連續(xù)的步驟。第 1步 PCR用引物 5’-ACAGAATTCTAGAACCCCAGTGGAAAG ACGCGCAG-3’(正義鏈 U f1)、5’-GGTGTTTCGTCCTTTCCA CAAG-3’(反義鏈U r1),模板 pBS-hU 6-1,擴增出含hU 6啟動子 (含 XbaⅠ酶切位點)的寡核苷酸片段(f1)。用 10 g/L TAE瓊脂糖凝膠、凝膠純化試劑盒回收預(yù)期 340 bp大小的 PCR產(chǎn)物片段。第 2步PCR使用配對引物 Cf1、C r1(表 1)擴增出能使PTEN基因沉默的 shRNA(含 XhoⅠ酶切位點)片段(f2)。用 120 g/L TAE聚丙烯酰胺凝膠純化,回收80 bp的 PCR產(chǎn)物片段。第 3步 PCR用U f1、Cr1作引物,f1和 f2的混合物作模板,擴增出 U 6-shPTEN片段,用 10 g/L TAE瓊脂糖凝膠、凝膠純化試劑盒回收 420 bp大小的 PCR產(chǎn)物片段 (f3)。之后用pFLRu-GFP作載體,f3作為插入片段,用 XbaⅠ/ XhoⅠ酶切,分別回收并純化 9000及 420 bp片段。用 T4DNA連接酶連接后,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 (E.co li)XL10感受態(tài)細(xì)胞,涂布氨芐青霉素抗性 (100 Mg/L)平板,37℃過夜培養(yǎng)。對陽性克隆提取質(zhì)粒;用 XbaⅠ/XhoⅠ/B aMHⅠ酶切對質(zhì)粒初步鑒定,選擇有 9000、1 200和 420 bp片段的質(zhì)粒測序。U 6前引物測序驗證,序列為 5′-GTTGGCGAGT GTGTTTTGTGAAG-3′。

1.3 PTEN基因 RESC救援慢病毒載體的構(gòu)建

通過 3步 PCR從人類 PTEN基因的 cDNA擴增出PTEN蛋白的全長編碼區(qū)。前 2步 PCR分別用CF1/CR1和 CF2/CR2(表 1)作引物,其中引物 CR1 和CF2包含 4個點同義突變,人 PTEN cDNA(Thermo Scien tific公司,美國)作模板擴增出對應(yīng) shRNA位置有同義突變的、大小為 650 bp(F1)和 560 bp (F2)的 2段 MRNA片段,用 10 g/L TAE瓊脂糖凝膠回收 F1和 F2。第 3步 PCR用 CF1和 CR2作引物,F1和 F2的混合物作模板擴增出在 PTEN的 shRNA序列對應(yīng)的位置含有同義突變的突變后的全長片段 (F3),回收預(yù)期為 1 200 bp左右 PCR產(chǎn)物片段。pFLRu-U 6-shPTEN作載體,F3為插入片段,用上述方法把 F3片段亞克隆到 pFLRu-U 6-shPTEN質(zhì)粒的 Eco RⅠ/B aMHⅠ酶切位點。陽性克隆經(jīng)XbaⅠ/XhoⅠ/Eco RⅠ/BaMHⅠ酶切初步鑒定,選擇有 9000、1 200和 420 bp片段的質(zhì)粒測序鑒定。測序上游引物：5′-GTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAG-3′;測序下游引物：5′-CTGAGGATCCTTTGATT GAAGAGCTTTCTTTATG-3′。

1.4 慢病毒的包裝和滴度測定 用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞,細(xì)胞密度為15×106L-1時重新接種于直徑10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,37℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細(xì)胞達(dá) 70%融合時進行轉(zhuǎn)染。用Op ti-MEM培養(yǎng)基,在 TRANSIT介導(dǎo)下,使用慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.2ΔR和pCMVVSV-G混合物(質(zhì)量比8：1混合)分別與慢病毒質(zhì)粒 pFLRu-U 6-shPTEN和 pFLRu-U 6-rrshPTEN共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞;轉(zhuǎn)染后24 h用含體積分?jǐn)?shù) 10%FBS 的MEMA lpha培養(yǎng)基對細(xì)胞進行換液處理;轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞上清,1 200 r/Min離心5min,然后使用0.45μm的過濾器過濾上清液。慢病毒貯液梯度稀釋 (10-1～10-6)。剩余病毒-80℃保存?zhèn)溆?。DMEM培養(yǎng)液重懸 N IH3T3細(xì)胞至 4×106L-1,在96孔板每孔中加100μL重懸細(xì)胞、45μL病毒顆粒稀釋液,感染細(xì)胞,37℃溫育8 后,更換含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡下檢測 GFP表達(dá)量,病毒滴度為表達(dá) GFP的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 雙鏈寡核苷酸的合成 將針對目標(biāo)基因PTEN特異性的干擾單鏈寡核苷酸行退火處理,得到雙鏈寡核苷酸產(chǎn)物(圖 1)。

圖1 PTEN基因干擾片段雙鏈寡核苷酸電泳圖M：Marker;1：PTEN基因的干擾片段。

2.2 pFLRu-U6-shPTEN和 pFLRu-U6-rrshPTEN陽性克隆測序鑒定 測序及在 GenBank數(shù)據(jù)庫B last分析與其他基因的同源性后,證實所得結(jié)果與實驗要求的 DNA序列完全一致,提示 pFLRu-U 6-shPTEN和 p FLRu-U 6-rrshPTEN均為陽性克隆。

2.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定 測得 pFLRu-U6-shPTEN和 pFLRu-U6-rrshPTEN2種慢病毒的病毒滴度分別為6.0×105和5.0×105pfu/mL。說明有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 293T細(xì)胞,病毒成功包裝。

3 討論

PTEN基因[1]定位于染色體 10q23.3,由 9個外顯子和 8個內(nèi)含子構(gòu)成,其 cDNA序列包含由1 209個核苷酸組成的開放閱讀框架,編碼 403個氨基酸組成的蛋白質(zhì),其編碼產(chǎn)物具有雙重磷酸酶活性。PTEN作用于AKT信號傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié),通過脂質(zhì)磷酸酶活性抑制 PI3K的磷酸化,阻斷AKT/蛋白激酶B(PKB)途徑,在胞質(zhì)細(xì)胞信號傳遞誘導(dǎo)凋亡、介導(dǎo) G1期停滯、影響基因的表達(dá)、抑制細(xì)胞遷移、浸潤和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞鋪展及局部黏附等過程中起著重要作用[8]。它通過抑制 pMAK細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞生長分化[9]。因此 PTEN在正常表達(dá)時可抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移及浸潤。PTEN的突變或雜合丟失可導(dǎo)致 PTEN編碼蛋白表達(dá)缺失,從而導(dǎo)致某些惡性腫瘤的發(fā)生[2-3]。

RNA i由于能夠高效率、特異性地下調(diào)靶基因表達(dá),已被證明是一個在內(nèi)源性基因功能研究領(lǐng)域的有效工具,已成為分子生物學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)。慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,以H IV-1為基礎(chǔ)發(fā)展而得[10-11],能夠轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞,還能將病毒的遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞的基因組,感染后細(xì)胞可以穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)目的基因[12-13],是基因功能研究和基因治療中不可多得的優(yōu)良載體。然而隨著 RNA i技術(shù)的應(yīng)用,越來越多的證據(jù)[5-6]表明“脫靶效應(yīng)”在 RNA i中廣泛存在,它使實驗出現(xiàn)假陽性結(jié)果,直接影響了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了避免“脫靶效應(yīng)”的干擾,作者在研究中引入救援機制,根據(jù)氨基酸的簡并性,在核苷酸水平上改變靶基因,使其基因表達(dá)的天然蛋白編碼不變,同時又能妨礙 RNA i沉默,從而允許救援。構(gòu)建出的RESC救援慢病毒載體引入RNA i實驗中,如果能恢復(fù)由 RNA i引起的變化,則可以排除因 shRNA的脫靶效應(yīng)所引起的假陽性結(jié)果。

該研究中,作者用 PTEN基因作為靶基因,系統(tǒng)地論述了構(gòu)建 RNA i及其 RESC救援慢病毒載體體系的實驗過程。構(gòu)建 RNA i慢病毒載體時,根據(jù)Tusch l[14]設(shè)計原則,設(shè)計合成了 1對能表達(dá) PTEN基因的 shRNA單鏈寡核苷酸,GC含量在 35%～55%。中間添加 Loop結(jié)構(gòu) (TTCAAGAGA)。以堿基“G”開始,到“TTTTT”終止,使質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄從“G”開始。通過運用 2個重疊的單鏈寡核苷酸的 PCR合成了 shRNA的DNA模板。然后將這個基因片段與 hU 6啟動子融合并克隆到慢病毒載體 pFLRu-GFP中,從而得到 pFLRu-U6-shPTEN載體。構(gòu)建 RESC救援慢病毒載體時,針對 PTEN基因的mRNA序列對應(yīng)的 shRNA位置引入 4個點同義突變,使 shRNA不能作用于這種“外源”設(shè)計的mRNA。同義突變(CR2)滅活 PTEN基因 cDNA的終止密碼子。在其兩端分別加入酶切位點,以便基因操作及識別。把這個具有抗 shRNA的基因片段與 GFP融合后亞克隆到慢病毒載體 pFLRu-U 6-shPTEN中,得到一個載體內(nèi)既有 shRNA的表達(dá),又有抗RNA i的 cDNA表達(dá)的 RESC救援慢病毒載體pFLRu-U 6-rrshPTEN。

該研究中所開發(fā)構(gòu)建的 RNA i及其 RESC救援慢病毒載體體系有以下優(yōu)點：①該研究所使用的慢病毒載體可轉(zhuǎn)染體內(nèi)非分裂期、休眠期細(xì)胞或體外生長阻止細(xì)胞;帶有目的基因的遺傳物質(zhì)能夠整合到宿主基因組中,同時能夠穩(wěn)定表達(dá)[13]。②siRNA通過細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成,而不是化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄。這是一個在 RNA i表達(dá)中 siRNA合成的便捷的方法。③抗 siRNA目的基因的 cDNA與 shRNA表達(dá)在同一個載體中,用來恢復(fù)實驗中由 RNA i引起的表型改變。雖然作者的慢病毒載體體系并沒有消除潛在的“脫靶效應(yīng)”,它卻能夠明確判斷實驗中表型改變是由 siRNA誘導(dǎo)沉默引起或所謂的“脫靶”的效果。因此,在該研究中提出的構(gòu)建 RNA i及其RESC救援慢病毒載體的體系在基因功能研究中具有普遍的適用性。

總之,作者通過酶切、測序等篩選出 PTEN基因RNA i的有效靶序列后,應(yīng)用 293T細(xì)胞作為包裝細(xì)胞,在包裝后產(chǎn)生了高滴度的病毒顆粒,同時表達(dá)報告基因 GFP。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了含有 GFP報告基因的 PTEN基因的 RNA i慢病毒載體及其 RESC救援慢病毒載體,為進一步研究 PTEN基因功能并探討其在細(xì)胞遷移過程中的機制奠定了基礎(chǔ)。

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(2009-12-02收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

可能已具有了某種人格特質(zhì)和生物學(xué)基礎(chǔ),從而成為焦慮障礙發(fā)生的易感素質(zhì),在生活事件和不良社會環(huán)境共同作用下,導(dǎo)致了焦慮障礙的發(fā)生。

致謝 感謝香港中文大學(xué)張妙清教授、中國科學(xué)院心理研究所張建新教授提供了量表和悉心指導(dǎo)!

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(2009-06-12收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Construction and identification knockdown and RESC concurrent rescue of RNA i lentiviral vector on human PTEN gene

WANG YuMei1,2,3),SHENG Guangyao1)

1)D epartMen t of Ped ia trics,the First Affilia ted Hospita l,Zhengzhou Un iversity,Zhengzhou 450052 2)D epartMen t of Ped ia trics,the Th ird Affilia ted Hospita l,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052 3)D ivision of HeMa tology,Schoo l of Med icine,W ashing ton University in St.Louis,MO 63110-1093

PTEN gene;lentiviral exp ression vector;RNA interference;RNA interference escape strategy construct; off-target effect

A im：To construct the lentiviral exp ression vectors of huMan PTEN fo r RNA i and for concurrent rescue of RNA i escape strategy construct(RESC).Me thods：PTEN shRNA sequence of huMan was designed by on-line designer software on Co rp. Invitrogen.A fter synthesis and annealing,doub le strand o ligonuc leo tides(dso ligoes)that d igested w ith XbaⅠand XhoⅠwere cloned into the pFLRu-GFP p lasMid and lentiviral exp ression vector of pFLRu-U 6-shPTEN was obtained.Based on pFLRu-U 6-shPTEN,exogenousmRNA of PTEN were d rawn into RNA i,and the vector of coMbining the exp ression of shRNA and rescue cDNA in the saMe vector pFLRu-U 6-rrshPTEN were gotten after being digested w ith Eco RⅠand BaMHⅠenzyMes.Theywere then transfor Med into cheMically competent E.coli XL10b lue bacteria.And after identification by sequencing and digestion,293T cell line was transfected by above positive recoMbined p las Mids and len tiviral packingMaterials pCMV-dR8.2ΔR and pCMV-VSV-G p lasMids.Theywere incubated for 48 to 72 h in a 37℃,5% CO2incubator.Cu lture supernatantwas harvested and stored at-80℃,then the virus titerwas deter Mined by serial dilution assay.Resu lts： It was showed that all the p las Mids,recoMbinant vectors pFLRu-U 6-shPTEN and pFLRu-U 6-rrshPTEN,were positive c lone vecto rs after screening positive c lones by aMp icillin,d igested and sequenced by the use of p riMer for ward ofU 6 p riMer.Conc lusion：Lentiviral shRNA exp ression vector and RESC vecto r coMbining the exp ression of shRNA and concurrent rescue cDNA in the saMe vector are successfu lly constructed.They obviate to Misinterp retation of phenotypes as a result of false-positive responses by off-target effectively and p rovide the stable transfection vectors for research on PTEN gene.

?圖分類號 Q782