醋酸鉛對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞活性及抑制素 BMRNA水平的影響＊

蘇曉東1),李春陽2),高慧艷1),趙士光3),陳小玉1)#
1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001 3)衢州市疾病預(yù)防控制中心衢州 324000
#通訊作者,女,1957年 11月生,碩士,教授,研究方向：生殖與發(fā)育毒理,E-Mail：chen-xiaoyu@zzu.edu.cn

醋酸鉛;睪丸支持細(xì)胞;抑制素;大鼠

目的： 觀察醋酸鉛對(duì)體外培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞活性和抑制素B( INH B)mRNA水平的影響。方法：建立大鼠睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,分別給予不同濃度 (0、10-8、10-7、10-6和 10-5mo l/L)的醋酸鉛處理細(xì)胞,培養(yǎng) 24 h后采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性;同法分組,采用 RT-PCR檢測(cè) INH B mRNA的表達(dá)。結(jié)果：各組細(xì)胞活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.451,P=0.064);各組細(xì)胞 INH B mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F= 9984.370,P＜0.001),醋酸鉛濃度在 10-8和 10-7mo l/L時(shí),睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞 INH B mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論：醋酸鉛對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞可能有毒性作用。

NH B)mRNA in Sertoli cellsof rats.Me thods：The Serto li cellswere allocated into 5 groups and given lead acetate at0, 10-8,10-7,10-6,and 10-5mo l/L,respectively.MTTMethod was used to observe the cell activity.The Serto li cellswere allocated as above,and the INH B mRNA levelwasMeasured by RT-PCR.Resu lts：The cell activity of Serto li cells had no significant difference among the 5 groups(F=2.451,P=0.064).The exp ression level of INH B mRNA had significant difference among the 5 groups(F=9984.370,P＜0.001),and the exp ression levels of INH B mRNA in 10-8and 10-7mo l/L groupswere higher than thatof contro l group(P＜0.05).Conc lus ion：Lead acetate cou ld affect the exp ression level of INH B mRNA in Serto li cells,which has toxic effects on the Serto li cells.

鉛是人類最早開始使用的重金屬之一。隨著現(xiàn)代工業(yè)和交通業(yè)的迅猛發(fā)展,鉛的大量廣泛使用,使其已成為嚴(yán)重的環(huán)境污染物。鉛能對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)和器官造成損傷,并能影響動(dòng)物和人類的生殖功能[1-2]。睪丸支持細(xì)胞在生精過程中起著非常重要的作用,其重要產(chǎn)物抑制素 B(inhibin B, INH B)能反映睪丸支持細(xì)胞的功能狀態(tài)[3]。作者觀察了不同濃度醋酸鉛對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞活性及 INH B mRNA水平的影響,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 18～20日齡普通級(jí)雄性 SD大鼠 4～6只,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)液 (Gibco公司),胎牛血清 (Hyc lone公司),膠原酶 Ⅰ(SigMa公司),胰蛋白酶(AMresco公司),HEPES培養(yǎng)基 (AMresco公司),二甲基亞砜 (DMSO,SigMa公司),其他試劑均為市售分析純。目的基因 INH B(擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 253 bp)

＊河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 0611045300上游引物 5’-TGCCCTGGATGGCTGTAT-3’,下游引物5’-TGTCCCTGTCCCAAGAGTAAG-3’;內(nèi)參 GAPDH(擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 292 bp)上游引物 5’-TGTC CCTGTCCCAAGAGTAAG-3’,下游引物5’-CAGTCT TCTGAGTGGCAGTGAT-3’;均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 睪丸支持細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)與鑒定 參照文獻(xiàn)[4]方法：頸椎脫臼法處死大鼠,體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒后取出雙側(cè)睪丸,用 D-Hank’s液洗凈并剪碎至 1 mm3大小,加入 3 mL 2.5 g/L胰蛋白酶液消化 30 Min,離心后加入 2 mL 1 g/L膠原酶Ⅰ液消化 20 Min,100目不銹鋼篩過濾。加入適量含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液吹打混勻,調(diào)整細(xì)胞密度至 (2～4)×105mL-1,接種于 6孔板,35℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2飽和濕度下培養(yǎng) 48 h后,加入 20 mmo l/ L的 Tris-HCl低滲液純化處理 5 Min。加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù) 48 h后,采用 Feu lgen染色法鑒定支持細(xì)胞。

1.3 睪丸支持細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT法。取細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為 (2～4)×105mL-1,每孔200μL接種于 96孔板。48 h后低滲純化,繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,然后加入醋酸鉛工作液,使終濃度分別為10-8、10-7、10-6和 10-5mo l/L,另設(shè)對(duì)照組 (加入培養(yǎng)液),每個(gè)濃度設(shè) 8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后取出培養(yǎng)板,每孔加入 5 g/L MTT溶液 20μL,在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,中止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)的上清液,每孔加入 150μL DMSO,振蕩 10 Min使藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上 492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度(A)值。

1.4 睪丸支持細(xì)胞 INHBMRNA表達(dá)測(cè)定 采用RT-PCR方法。細(xì)胞染毒 24 h后終止,用 Trizo l試劑提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：總體系 25μL。10× PCR Buffer2.5μL,dNTPMixture 2μL,上、下游引物各 1.0μL,Taq酶 0.2μL,cDNA模板 1.0μL,滅菌雙蒸水 17.3μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 Min;94℃變性 30 s,(IHN B 48℃,GAPDH 54℃)退火 45 s,72℃延伸 1 Min,循環(huán) 35次;72℃終延伸10 Min。取擴(kuò)增產(chǎn)物在 20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,應(yīng)用圖像分析儀測(cè)定灰度值,以 INH B與 GAPDH灰度的比值代表mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用 SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析比較支持細(xì)胞活性和 INH B mRNA的表達(dá)水平,兩兩比較采用 SN K-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 睪丸支持細(xì)胞的鑒定 Feu lgen染色可見胞質(zhì)呈網(wǎng)狀,為綠色,核呈淡紫色,核仁區(qū)著色較淺,核仁兩側(cè)可見 2個(gè)深紫色的顆粒,為支持細(xì)胞特異的衛(wèi)星核小體,與核仁呈三角形排列,證明培養(yǎng)細(xì)胞為支持細(xì)胞。

2.2 各組大鼠睪丸支持細(xì)胞活性和 INH B MRNA表達(dá)水平比較 結(jié)果見圖 1、表 1。

表1 各組大鼠睪丸支持細(xì)胞活性和 INH B MRNA表達(dá)水平比較

圖1 各組大鼠睪丸支持細(xì)胞 INH B MRNA的 RT-PCR測(cè)定結(jié)果

3 討論

睪丸支持細(xì)胞能為生精細(xì)胞提供支架、參與血睪屏障,供給生精過程所需的能量及營養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)能分泌數(shù)十種活性物質(zhì),如 INH、轉(zhuǎn)鐵蛋白、雄激素結(jié)合蛋白及生長(zhǎng)因子等,參與生精細(xì)胞分化和成熟的調(diào)節(jié),被稱為是生精細(xì)胞的“保姆細(xì)胞”[5]。支持細(xì)胞的數(shù)量和功能正常對(duì)精子發(fā)生有至關(guān)重要的作用[6]。 INH是支持細(xì)胞分泌的一種糖蛋白類激素,屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族中的一員,是由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基通過二硫鍵構(gòu)成的異質(zhì)二聚體,由于β亞基有βA和βB 2種,因此 INH也有 INH A (α βA)和 INH B(α βB)2種形式。研究[7]發(fā)現(xiàn),在成年男性血液循環(huán)中主要存在且具有生物學(xué)活性的是 INH B,它是評(píng)價(jià)睪丸生精功能最好最靈敏的直接指標(biāo)。Monsees等[8]指出,對(duì)睪丸支持細(xì)胞有毒性的化學(xué)物質(zhì)均能使其分泌 INH B的能力下降,因此,可以用支持細(xì)胞分泌 INH B的水平評(píng)價(jià)外源性化學(xué)物對(duì)支持細(xì)胞的毒性作用。

該研究結(jié)果表明,在 10-8～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)醋酸鉛對(duì)支持細(xì)胞活性無明顯影響。在支持細(xì)胞活性不受影響的前提下,作者應(yīng)用 RT-PCR法檢測(cè)了醋酸鉛對(duì) INH B mRNA表達(dá)水平的影響,結(jié)果顯示, 10-8和 10-7mol/L醋酸鉛均可引起 INH B mRNA的表達(dá)水平降低,但隨著劑量的升高, INH B mRNA的表達(dá)水平逐漸恢復(fù)正常,可能與醋酸鉛濃度升高時(shí)支持細(xì)胞代償性上調(diào) INH B mRNA的水平有關(guān)。

總之,該研究證明醋酸鉛能引起支持細(xì)胞 INH B表達(dá)水平的改變,但該研究是體外實(shí)驗(yàn),并且只是在轉(zhuǎn)錄水平探討了醋酸鉛對(duì) INH B mRNA表達(dá)的影響,對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和蛋白表達(dá)水平還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(2009-06-18收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of lead acetate on exp ression of inhibin B mRNA in rat Sertoli cells

SU X iaodong1),L I Chunyang2),GAO Huiyan1),ZHAO Shiguang3),CHEN X iaoyu1)

1)D epar tMen t of Toxico logy,Co llege of Public Hea lth,Zhengzhou U niversity,Zhengzhou 450001 2)D epar tMen t of O ccupa tiona lMed icine,College of Public Hea lth,Zhengzhou Un iversity,Zhengzhou 450001

3)Cen ter forD isease Preven tion and Con tro l of Quzhou C ity,Quzhou 324000

lead acetate;Sertoli cell;inhibin B;rat

A im：To investigate the effects of lead acetate on the cell activity and the exp ression level of inhibin B (I

Q 492.4