李俊 黃新生 王建中 白廣平 石穎*

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科,上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院耳鼻咽喉科,*病理科,上海 201700)

鼻息肉(nasal polyps)是鼻腔鼻竇黏膜的常見慢性疾病,以極度水腫的鼻黏膜在中鼻道形成單發(fā)或多發(fā)息肉為臨床特征。鼻息肉在人群中患病率較高,盡管Hippocrates已對(duì)鼻息肉有過描述[1],但其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明,因此臨床上用藥物和手術(shù)治療后仍存在著鼻息肉復(fù)發(fā)的情況。

近年來(lái)隨著對(duì)鼻黏膜中非腎上腺素能非膽堿能(NANC)神經(jīng)及其釋放的多種神經(jīng)肽的深入研究以及鼻神經(jīng)源性炎癥[2]概念的提出,越來(lái)越多的研究已經(jīng)證明神經(jīng)肽的局部釋放在調(diào)節(jié)生理或病理環(huán)境下鼻黏膜的血流和腺體分泌中起著重要的作用[3],神經(jīng)肽的生理或病理作用依賴于肽能神經(jīng)纖維在正常或病理組織中的具體分布及含量大小。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法研究神經(jīng)肽 Y(NPY)在人鼻息肉組織中的分布和含量,以及研究其在正常鼻黏膜組織中的表達(dá)差異情況,探討神經(jīng)肽Y在鼻息肉發(fā)病中的作用,旨在為治療鼻息肉提供一條新的思路。

1 資料與方法

1.1 材料來(lái)源 實(shí)驗(yàn)組60例,其中男性36例,女性24例,來(lái)源于2007年1月—2009年11月間就診于我院并初次進(jìn)行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者,留取鼻息肉標(biāo)本。根據(jù)1997年海口會(huì)議慢性鼻竇炎鼻息肉臨床分型分期標(biāo)準(zhǔn)[4],Ⅱ型1期22例,Ⅱ型2期8例,Ⅱ型 3期 11例,Ⅲ型19例,患者年齡18～67歲,平均年齡39歲。各病例均除外并發(fā)哮喘、囊性纖維化和免疫性疾病,且手術(shù)前1個(gè)月未應(yīng)用激素、減充血?jiǎng)┖涂菇M胺藥。對(duì)照組36例,其中男性10例,女性26例,年齡37～66歲,平均年齡46歲。取同一時(shí)期因鼻前庭囊腫切除術(shù)中行鼻底引流造孔時(shí)取的鼻黏膜,而且全部病例經(jīng)鼻竇CT證實(shí)為非慢性鼻竇炎鼻息肉各型患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材方法 術(shù)中所取的鼻黏膜和鼻息肉標(biāo)本,經(jīng)10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片4張 ,片厚 5μm。

1.2.2 所需試劑 兔抗人神經(jīng)肽Y多克隆抗體以及DAB染色試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色及病理診斷 具體步驟略,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組標(biāo)本均經(jīng)病理診斷為鼻息肉或鼻黏膜。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色切片脫蠟至水,滴加3%過氧化氫溶液10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗3 min,2次,PBS(pH 7.4)浸泡5 min;必要時(shí)進(jìn)行抗原修復(fù);PBS洗3 min,2次,滴加非免疫的動(dòng)物血清15 mim。吸取多余液體,增加一抗37度孵育1～2 h,PBS洗3 min,3次;加生物素標(biāo)記的二抗37度孵育15 min,PBS洗3 min,3次,加鏈霉素抗生物素過氧化酶(三抗)37度孵育15 min,PBS洗3 min,3次;加DAB顯色劑,顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間;自來(lái)水沖洗,蘇木精輕度復(fù)染;脫水,透明,中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果分析

1.3.1 定性分析 用已知的陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,PBS取代一抗作陰性對(duì)照,以排除非特異性染色。棕黃色顆粒為陽(yáng)性神經(jīng)纖維或細(xì)胞,陽(yáng)性程度根據(jù)染色強(qiáng)度判斷。

1.3.2 定量分析 采用BI-2000多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限責(zé)任公司)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。每張切片于100倍視野選取不相重疊的5個(gè)陽(yáng)性部位,在同一標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量窗下,測(cè)量鎖定區(qū)域內(nèi)陽(yáng)性物質(zhì)的積分吸收度(IOD),取平均積分吸收度值(IODM)為該標(biāo)本的測(cè)量結(jié)果。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 選用Stata7統(tǒng)計(jì)軟件,行單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色 實(shí)驗(yàn)組患者鼻息肉的神經(jīng)肽Y(NPY)陽(yáng)性纖維較對(duì)照組明顯減少并變細(xì),陽(yáng)性減弱,少量存在于鼻息肉基底部擴(kuò)張的腺腔、血管周圍以及腺泡細(xì)胞之間,陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較淺的棕黃色顆粒,見圖1,2。

2.2 實(shí)驗(yàn)組患者鼻息肉的NPY陽(yáng)性細(xì)胞集中部位的平均積分吸收度(IODM)明顯低于對(duì)照組,見表1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 NPY在鼻息肉中的表達(dá)(SP×200)

圖2 NPY在鼻黏膜中的表達(dá)(SP×200)

表1 兩組NPY的IODM比較 ()

表1 兩組NPY的IODM比較 ()

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05

實(shí)驗(yàn)組 60 1427.18±129.54*對(duì)照組 36 1846.93±164.35

3 討 論

鼻息肉的病因和發(fā)病機(jī)制不明,目前認(rèn)為是多種機(jī)制導(dǎo)致的慢性炎性過程的終末產(chǎn)物。至今已有中鼻道微環(huán)境學(xué)說、鼻變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和細(xì)菌超抗原學(xué)說等。中鼻道微環(huán)境的某些特性,使該部易感性增高。在炎性因子刺激下,上皮細(xì)胞和免疫活性細(xì)胞合成、釋放IL-5及多種炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì),使嗜酸性粒細(xì)胞在局部聚集、釋放多種毒性蛋白和細(xì)胞因子,致使血管通透性增高,血漿滲出、組織水腫,張力增高,上皮破裂繼之增殖,細(xì)胞外基質(zhì)也隨之增生,血管、腺體長(zhǎng)入,逐漸形成息肉[5]。

目前已經(jīng)證實(shí)人鼻黏膜中不僅存在膽堿能和腎上腺素能神經(jīng)纖維,還存在非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)纖維(NANC)[6]。長(zhǎng)期以來(lái)廣大學(xué)者認(rèn)為膽堿能和腎上腺素能神經(jīng)纖維在人鼻黏膜生理功能中起著主導(dǎo)作用,但是,隨著近年來(lái)對(duì)非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)以及神經(jīng)肽的深入研究,越來(lái)越多的事實(shí)已經(jīng)證明神經(jīng)肽的局部釋放在人鼻黏膜中起著重要的生理和病理作用[7]。鼻息肉形成的組織病理變化主要為血管擴(kuò)張、外滲、組織水腫等現(xiàn)象,可用鼻黏膜中的非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)釋放的神經(jīng)肽來(lái)解釋[8]。神經(jīng)肽主要包括P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、血管活性腸肽(VIP)、NPY、一氧化氮合酶(NOS)。NPY是哺乳動(dòng)物中含量最高,分布最廣的神經(jīng)肽,它屬胰多肽相關(guān)肽,是一種36肽酰胺,其基因定位于第7號(hào)染色體上,包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,基因表達(dá)受調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的各種內(nèi)分泌因子等很多因素的調(diào)節(jié),NPY在鼻黏膜中主要存在于小動(dòng)脈,少量存在于靜脈竇及黏膜下腺體[9]。NPY與NOS共存于NADPH(還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶)陽(yáng)性神經(jīng)纖維中[10],有時(shí)NPY也與降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)共存,并發(fā)揮收縮血管、調(diào)控鼻黏膜的微循環(huán)和腺體分泌等作用,具有抑制擴(kuò)血管物質(zhì)的作用[11]。Giger等[12]在研究慢性鼻竇炎患者時(shí)發(fā)現(xiàn),鼻黏膜中炎癥細(xì)胞變得更密集而且NPY受體活性降低。Fang等[13]曾在20例患者的鼻息肉組織中發(fā)現(xiàn)NPY和血管活性腸肽(VIP)存在表達(dá),而未發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)(SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的存在,并據(jù)此推測(cè)NPY和VIP在鼻息肉形成中可能發(fā)揮作用。在麻醉的豬和人的鼻及氣管的組胺激發(fā)反應(yīng)試驗(yàn)觀察中,有學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn)激活NPY受體可以拮抗由組胺激發(fā)的鼻阻力增加、腺體分泌增多等癥狀,這些癥狀的病理現(xiàn)象類似鼻息肉形成時(shí)的諸如血管擴(kuò)張、外滲、組織水腫等病理現(xiàn)象。本研究的結(jié)果也表明對(duì)照組正常鼻黏膜組NPY陽(yáng)性神經(jīng)纖維主要分布于小動(dòng)脈、靜脈竇以及腺體的周圍,而實(shí)驗(yàn)組NPY陽(yáng)性纖維在鼻息肉組織中分布明顯減少,陽(yáng)性物質(zhì)顏色較淺,只有少量分布在增生擴(kuò)張的腺體周圍,與各文獻(xiàn)報(bào)道一致;其在兩組中的含量測(cè)定采用陽(yáng)性纖維的平均積分吸收度作半定量分析,本研究發(fā)現(xiàn)NPY在實(shí)驗(yàn)組鼻息肉組中的含量要明顯少于對(duì)照組,而且此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,NPY在鼻息肉發(fā)病中很可能具有重要的作用。

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