栗景蕊,付 瑞,李曉波,賀爭鳴

(中國藥品生物制品檢定所,北京 100050)

技術(shù)方法

猴泡沫病毒(SFV)RT-nestedPCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

栗景蕊,付 瑞,李曉波,賀爭鳴

(中國藥品生物制品檢定所,北京 100050)

目的建立實驗猴群及相關(guān)生物制品猴泡沫病毒(SFV)的 PCR檢測方法。方法選擇 SFV-1、SFV-3、SFVCPZ前病毒序列的 pol基因同源性較高的區(qū)域設(shè)計嵌套引物對 SFV-1毒種進行 RT-nestedPCR擴增并克隆測序,以確定其準確性,通過驗證方法的特異性和敏感性,初步應(yīng)用該方法對恒河猴外周血淋巴細胞 (PBLs),常用猴腎傳代細胞及猴源性生物制品進行檢測。結(jié)果經(jīng) RT-nestedPCR擴增出的片斷與 SFV-1 cDNA序列同源性達到99%,對 10只恒河猴的檢測結(jié)果為 5只陽性,5只陰性,對常用猴腎傳代細胞及脊髓灰質(zhì)炎疫苗的檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論所建立的 SFV RT-nestedPCR檢測方法能準確的檢測出恒河猴 SFV的感染情況,對控制實驗猴群的質(zhì)量具有重要意義。該方法可用于檢測猴源性生物制品中 SFV的污染情況,為保證生物制品應(yīng)用的安全性提供一定依據(jù)。

猴泡沫病毒;逆轉(zhuǎn)錄-巢式 PCR;外周血淋巴細胞

猴泡沫病毒 (SFV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科,泡沫反轉(zhuǎn)錄病毒亞科。Wolfe等[1]在喀麥隆村民中檢出SFV抗體,并證明 SFV可傳染給人。美國華盛頓大學(xué)國家靈長類動物研究中心等機構(gòu)的研究人員[2]在印尼巴厘島發(fā)現(xiàn)亞洲首例 SFV,并發(fā)現(xiàn)其自然宿主是非人靈長類動物如恒河猴和黑猩猩。猴可終生無癥狀攜帶 SFV,人類則可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)的退行性疾病[3]。SFV與 S IV的結(jié)構(gòu)極為相似,國外有報道稱泡沫病毒(FV)可加劇艾滋病 (A IDS)的進行性發(fā)展,可能的機理是泡沫病毒(FV)可通過激活免疫缺陷病毒基因的表達而致病[4]。猴是常用的模式動物,目前很多疫苗類生物制品需用猴的組織,如恒河猴腎細胞(RMK)用作脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗生產(chǎn)的細胞基質(zhì),非洲綠猴腎細胞 (Vero)用作狂犬疫苗生產(chǎn)的細胞基質(zhì),而猴群中 SFV感染率高達 70%,為了保證猴群質(zhì)量,防止 SFV在人群中傳播,建立有效的 SFV檢測方法勢在必行。WHO第 49次生物標準化專家委員會會議對脊髓灰質(zhì)炎疫苗規(guī)程作出明確補充,指出用于疫苗生產(chǎn)的猴腎細胞應(yīng)是來自隔離猴群泡沫病毒抗體陰性的猴體。因此,建立靈敏準確的 SFV檢測方法對于監(jiān)測猴群 SFV的感染情況,保證生物制品生產(chǎn)用猴的質(zhì)量意義重大。我們建立的 RT-nestPCR法能夠快速、準確的檢測猴群中 SFV的感染情況,同時也為生物制品安全性控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 毒種和培養(yǎng)細胞

SFV-1株,購自美國 ATCC,編號:VR-276。培養(yǎng)細胞為幼倉鼠腎傳代細胞 (BHK-21),本室保存。

1.2 病毒培養(yǎng)及細胞病變觀察

將 SFV-1株接種BHK-21細胞并進行連續(xù)傳代培養(yǎng),觀察細胞病變 (Cytopathogenic effect,CPE)[5],同時測定 TC ID50。

1.3 引物設(shè)計與合成

分析已報道的猴泡沫病毒基因組序列,選擇SFV-1、SFV-3、SFVCPZ前病毒序列的 pol基因同源性較高的區(qū)域設(shè)計嵌套引物 (圖 1),該區(qū)域高度保守,與同科病毒進行序列比對,特異性較好。引物序列見圖 1,由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成,第二輪擴增產(chǎn)物大小為 410 bp。

圖 1 嵌套引物序列及在 SFV-基因組的位置Fig.1 Schematic representation of the SFV-1 genome indicating the position of the pr imer pairs

1.4 主要試劑及儀器

AMV RTase,隨機引物均購自 Promega公司,LA Taq DNA聚合酶,dNTP Mixture和 100 bp DNA ladder均購自 Takara公司。PCR儀和電泳儀,均購自B IO-RAD公司。

1.5 總RNA提取

采用 Invitrogen公司的 TR Izol Reagent一步法從細胞培養(yǎng)液或組織中提取 RNA,詳細操作步驟見說明書。

1.6 猴外周血淋巴細胞的分離

靜脈抽取猴外周血 1.5 mL,EDTA抗凝,用 Ficoll法分離淋巴細胞,分離步驟詳見說明書,最后PBS洗兩遍備用。

1.7 反轉(zhuǎn)錄與 nestPCR過程

通過優(yōu)化反應(yīng)條件及體系濃度,確定 RT-nestPCR檢測方法。

1.8 PCR產(chǎn)物的檢測

取 5μL擴增產(chǎn)物于 1.5%瓊脂糖凝膠 (含 0.5 μg/mL溴乙錠)進行電泳鑒定。電泳緩沖液為 1× TAE(0.04 mol/L Tris乙酸,0.001 mol/L EDTA, pH8.0),120 V電泳 30 min,在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置,以 100 bp DNAladder為參照物,判定結(jié)果。將 RT-nestPCR陽性擴增片段進行克隆測序,通過與 SFV序列進行比對以確定 PCR擴增的準確性。

1.9 RT-nestPCR方法特異性的測定

應(yīng)用所建立的 RT-nestPCR方法同時檢測猴泡沫病毒BHK-21細胞培養(yǎng)液、小鼠淋巴細胞白血病病毒(MuLV)、人類免疫缺陷病毒 (H IV)、麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒活疫苗及正常BHK-21細胞培養(yǎng)液以測定其特異性;將 RT-nestPCR陽性擴增片段進行克隆測序,以進一步驗證方法的特異性。

1.10 RT-nestPCR方法敏感性的測定

取 TC ID50值為 5.25的病毒液,用 PBS做倍比稀釋,分設(shè) 10-1到 10-9九個稀釋度。取每個稀釋度病毒液各 0.5 mL制備模板進行 RT-nestPCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,判斷所能擴增的最小病毒滴度;將起始濃度為 26.17μg/mL的 RNA樣本做倍比稀釋,分設(shè) 10-1到 10-9九個濃度梯度進行 RT-nestPCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,判斷所能擴增的最小 RNA模板濃度。

1.11 檢品來源

在方法的初步應(yīng)用中,所檢測的猴抗凝血均采自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所飼養(yǎng)的 10只恒河猴,所檢測的兩批口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明生物所生產(chǎn),批號為 2007120227和2007120118;所檢測的五種常用的猴腎傳代細胞MA104、Vero-E6、MK2、MEK、Vero均為本室保存。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細胞的病變及 TC I D50的測定

SFV-1接種BHK-21細胞后 3 d呈現(xiàn)出明顯的細胞病變 (圖 2見彩插 3),使 BHK-21細胞圓縮脫落,經(jīng)測定感染滴度為 105.25TC ID50/0.1 mL。

2.2 檢測方法的建立

用 TR Izol Reagent一步法從 SFV BHK-21細胞培養(yǎng)液中提取 RNA后,對反轉(zhuǎn)錄體系和 nestPCR體系及條件分別進行了優(yōu)化,確定了如下體外擴增方案:反轉(zhuǎn)錄體系總體積 25μL,其中無 Rnase水 7μL,5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 5μL,dNTPmix(2.5 mmol/L each)4 μL,隨機引物0.5μL,RNA模板8μL,AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)0.5μL,反應(yīng)條件為 37℃90 min,72℃15 min,4℃5 min。將產(chǎn)物 cDNA凍存于 -20℃?zhèn)溆? nestPCR體系第一次擴增總體積為 25μL,包括 ddH2O 13.25μL,10×LA反應(yīng)緩沖液 2.5μL,Mg2+(25 mmol/L)2μL,dNTPmix(2.5 mmol/L each)3μL,上下游引物各1μL,cDNA模板 2μL,LA-TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.25μL。第一次擴增使用 P1、P2引物,反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min;94℃1min,50℃1 min,72℃1 min,共 35個循環(huán);72℃再延伸 10 min,最后 4℃5 min。第二次擴增總體積為 25μL,其中, ddH2O 12.75μL,10×LA反應(yīng)緩沖液 2.5μL,Mg2+(25 mmol/L)2.5μL,dNTPmix(2.5 mmol/L each)3 μL,上下游引物各 1μL,LA-TaqDNA聚合酶(2.5 U/ μL)0.25μL,第一次擴增后從擴增產(chǎn)物中取 2μL作為第二次擴增的模板,用 P3、P4引物進行第二次擴增。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5 min;94℃ 1 min, 53.8℃1 min,72℃1 min,共 40個循環(huán);72℃再延伸10 min,最后 4℃5 min。

2.3 檢測方法的特異性

用所建立的 RT-nestPCR方法檢測猴泡沫病毒BHK-21細胞培養(yǎng)液為陽性結(jié)果,檢測小鼠淋巴細胞白血病病毒(MuLV)、人類免疫缺陷病毒(H IV)、麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒活疫苗及正常BHK-21細胞培養(yǎng)液均為陰性(圖 3)。將陽性擴增片斷進行克隆測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析,與 GenBank中 SFV-1核酸序列同源性為 99%(圖 4),說明該方法特異性較好。

圖 3 RT-nestPCR檢測 SFV的特異性測定Fig.3 Specificity of detection of SFV by RT-nestPCR

圖4 SFV-1測序BLAST分析比對Fig.4 Blast of SFV-1 measured sequence in GeneBank

2.4 檢測方法的敏感性

取感染滴度為 105.25TC ID50/0.1 mL的病毒液,用 PBS做 10倍稀釋,取每個稀釋度病毒液各 0.5 mL制備模板進行 RT-nestPCR擴增。結(jié)果顯示可檢測到稀釋度為 10-3的病毒核酸 (圖 5);將起始濃度為 26.17μg/mL的 RNA樣本做 10倍稀釋并進行RT-nestPCR擴增,結(jié)果顯示能夠檢測到的最小 RNA稀釋度為 10-5,即所能擴增的最小 RNA模板濃度為 0.26 pg/μL(圖 6)。

2.5 初步應(yīng)用

2.5.1 猴組織樣品的的檢測:采北京協(xié)爾鑫生物資源研究所 10只恒河猴的外周血,用 Ficoll法分離淋巴細胞,提取RNA,經(jīng)RT-nestPCR檢測,有5只恒河猴出現(xiàn)陽性條帶 (圖 7),經(jīng)測序M4與 SFV-1序列同源性為 98%,與 SFV-3序列同源性為 86%;M5與SFV-1序列同源性達到 99%,與 SFV-2序列同源性達到 97%,證明了檢測方法的準確性,同時也說明所建立的 RT-nestPCR方法能夠同時檢測出不同型別的 SFV。

2.5.2 常用猴腎傳代細胞的檢測:取MA104、Vero-E6、MK2、MEK、Vero五種常用的猴腎傳代細胞分別提取 RNA,經(jīng) RT-nestPCR檢測,五種細胞均未檢出SFV病毒核酸序列(圖 8)。

圖 5 RT-nestPCR檢測 SFV的敏感性測定——病毒液濃度梯度Fig.5 Sensitivity of detection of SFV by RT-nestPCR—concentration gradient of virus

圖 6 RT-nestPCR檢測 SFV的敏感性測定——RNA模板濃度梯度Fig.6 Sensitivity of detection of SFV by RT-nestPCR—concentration gradient of RNA

圖 8 常用猴腎傳代細胞及猴源性生物制品的檢測Fig.8 Detection of SFV by RT-nestPCR in passage monkey kidney cells and its related biological products

2.5.3 猴源性生物制品的檢測:取中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明生物所生產(chǎn)的兩批口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗分別提取 RNA,經(jīng) RT-nestPCR檢測,均未檢出 SFV核酸序列 (圖 8)。

3 討論

圖 7 RT-nestPCR檢測恒河猴外周血 SFVFig.7 Detection of SFV by RT-nestPCR in PBLs of rhesusmonkey

PCR技術(shù)由于其快速、安全且具有較高敏感性和特異性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。目前,國內(nèi) SFV的檢測主要采用 Kupiec等建立的 nest-PCR方法[6,7]。該方法針對不同型別的 SFV設(shè)計了不同的引物進行 PCR檢測,在應(yīng)用于實驗猴群的檢測時,程序較為復(fù)雜,不適用于批量檢測。我們所建立的 RT-nestPCR方法針對不同型別 SFV的 pol基因同源性較高的區(qū)域設(shè)計引物,理論上可以同時檢測 SFV-1, SFV-2,SFV-3及 SFVcpz等不同型別的 SFV,經(jīng)初步應(yīng)用于恒河猴的檢測證實了所建立的 RT-nestPCR方法能夠同時檢測出不同型別的 SFV,可用于對實驗猴群 SFV感染的篩查,提高了檢測效率。實驗結(jié)果表明,該方法具有良好的特異性,檢測與 SFV相似的病毒如MuLV,H IV,麻疹腮腺炎病毒均為陰性,無交叉反應(yīng)出現(xiàn),所擴增片段經(jīng)測序與 GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的 SFV序列同源性達到 99%,同時也說明該方法的準確性高。此外,nest-PCR經(jīng)過兩次擴增大大提高了檢測方法的敏感性,可以從感染滴度為 105.25TC ID50/0.1 mL的病毒中檢測到稀釋度為10-3的病毒核酸。

Lear的研究表明咽頭上皮、淋巴細胞是 SFV的主要富集處[8]。分離猴外周血淋巴細胞,應(yīng)用 RT-nestPCR方法檢測實驗猴群 SFV感染情況,具有采樣方便,快速簡便等優(yōu)勢。本實驗中從 10只恒河猴中檢出 5只 SFV陽性個體,與猴群中 SFV的高感染率較為一致。應(yīng)用所建立的 RT-nestPCR方法對常用猴腎傳代細胞及猴源性生物制品進行檢測,均未檢測到 SFV核酸序列,初步說明目前常用的猴腎傳代細胞以及猴源性生物制品污染 SFV的幾率較小或生產(chǎn)過程中病毒滅活效果較好。

由于 SFV經(jīng)常呈低水平感染或持續(xù)感染狀態(tài), SFV抗體的血清學(xué)檢測方法難以完全反映猴群 SFV帶毒狀況。加強實驗用猴和猴源性生物制品的病毒檢測不僅可以保證疫苗等生物制品的安全性,同時也減少了人類的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染率。我們所建立的檢測 SFV核酸的 RT-nestPCR方法具有快速、準確、特異、敏感等優(yōu)點,可以為猴群的帶毒狀況提供一個可靠的診斷方法,也適用于猴源性生物制品 SFV的檢測,對于控制 SFV傳播和人民用藥安全意義重大。

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Establishment and Application of Assay for the Detection of SFV by Reverse Transcription-nested Polymerase Cha in Reaction

L IJing-rui,FU Rui,L IXiao-bo,HE Zheng-ming
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo establish PCR testingmethod thatmonitor simian foamy virus in laboratorymonkeys and related biological products。MethodsDesigned two series pr imers of nested PCR according to the region which has high homology among SFV-1,SFV-3,SFVCPZin pol gene of SFV proviral DNA,then cloned and measured sequence for SFV-1 strain after RT-nestedPCR to determine its accuracy.After tested its specificity and sensitivity,to test peripheral blood lymphocytes of rhesusmonkey,passage monkey kidney cells and its related biological products by RT-nestedPCR method. Results Itwas 99%homology between the target segment by RT-nestedPCR and SFV cDNA in GeneBank,the testing result of peripheral blood lymphocytes of rhesus monkey by RT-nestedPCR were 5 positive and 5 negative,the testing results of passage monkey kidney cells and poliomyelitis vaccine were negative。ConclusionThis method is efficient to detect SFV in rhesusmonkey,and it has great significance for quality control of laboratorymonkeys.It also can be used to test SFV in related biological products,and provide some evidence to guarantee the security of biological products.

Simian foamy virus;RT-nestedPCR;Peripheral blood lymphocytes

Q939.47

B

1671-7856(2010)01-0046-06

2009-08-18

栗景蕊(1983-),女,碩士,研究方向:實驗動物病毒學(xué)。

賀爭鳴(1957-),男,研究員,博士,研究方向:實驗動物微生物學(xué)。E-mail:zhengminghe57@163.com