林自力，高雅，鄧桂馨，梁鴻斌，張鴻波，劉云海，倪和民，郭勇，王志剛

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)系，北京 102206;2.農(nóng)業(yè)部全國畜牧總站，北京 100125)

研究報告

PMSG和FSH同期發(fā)情處理對小鼠子宮、卵巢和輸卵管中雌激素α受體分布的影響

林自力1，高雅1，鄧桂馨1，梁鴻斌1，張鴻波1，劉云海1，倪和民1，郭勇1，王志剛2

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)系，北京 102206;2.農(nóng)業(yè)部全國畜牧總站，北京 100125)

目的從雌激素α受體(estrogen receptor α，ERα)的角度探討孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和促卵泡激素(follicle－stimulating hormone，F(xiàn)SH)處理小鼠的卵巢、輸卵管和子宮中，ERα分布是否有顯著性差異。方法10只8周齡母鼠，隨機分為處理方式不同的兩個組:PMSG組和FSH組，兩組均在處理第48小時取其卵巢、輸卵管和子宮樣固定，采用免疫組織化學(xué)法分別觀察組織中ERα分布情況。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，兩個處理組小鼠卵巢、輸卵管和子宮內(nèi)膜的細胞中都有ERα表達;PMSG處理組卵巢中的初級卵泡和成熟卵泡上ERα陽性率和平均吸光度均顯著高于FSH處理組;FSH處理組的輸卵管中ERα陽性率和平均吸光度均高于PMSG處理組;FSH處理組子宮基質(zhì)和腺上皮細胞中ERα的陽性率顯著高于PMSG組，其中PMSG組基質(zhì)中的平均吸光度顯著高于FSH組，而子宮內(nèi)膜上皮細胞的陽性率和平均吸光度兩處理組間差異無顯著性。結(jié)論PMSG和FSH同期發(fā)情誘導(dǎo)由于其特性可不同程度地影響小鼠卵巢、輸卵管和子宮中ERα的分布，使之在不同組織中產(chǎn)生差異性變化。

小鼠;卵巢;輸卵管;子宮;雌激素α受體分布

同期發(fā)情是胚胎移植、轉(zhuǎn)基因、克隆等研究不可缺少的基本技術(shù)環(huán)節(jié)，同期發(fā)情處理可以使哺乳動物受體的子宮處于胚胎著床“接受態(tài)”。胚胎發(fā)育到特定時期與子宮發(fā)生一系列的變化達到容受狀態(tài)的同步化對于胚胎的植入至關(guān)重要［1］，此時期與胚胎正常發(fā)育、子宮內(nèi)膜的容受性及適宜的內(nèi)分泌環(huán)境密切相關(guān)［2］，其中卵巢分泌的雌激素對小鼠的作用很重要［1］，雌激素是通過其受體(estrogen receptor，ER)發(fā)揮作用的，ER是核受體超家族中的一種配體依賴轉(zhuǎn)錄因子［3］，與雌激素發(fā)生結(jié)合引發(fā)下游的信號通路，調(diào)節(jié)生殖生理內(nèi)環(huán)境［4］，ER有其亞型，通過選擇性缺失研究它們特異性的作用發(fā)現(xiàn): α–/–的子宮發(fā)育不全而且不接受植入［5］，β–/–的子宮保持生物學(xué)功能和正常的植入［6］，說明ERα發(fā)揮了主要作用［1］，因此ERα的分布情況對于了解母體“接受態(tài)”具有重要的指導(dǎo)意義。雖已有人通過免疫組化的方法研究了激素處理同期發(fā)情小鼠子宮內(nèi)膜［7］或其他組織［8－10］中ER的分布情況，但多數(shù)僅針對發(fā)情小鼠子宮內(nèi)膜上激素受體的分布變化［11］，并未全面分析對比卵巢、輸卵管和子宮中ERα相對表達量的差異變化。本研究擬從ERα的角度探討PMSG和FSH同期發(fā)情處理后，此類受體在小鼠卵巢、輸卵管和子宮內(nèi)膜上的分布是否存有差異，同時結(jié)合ERα的陽性率和平均吸光度變化分析其相應(yīng)分布是否受內(nèi)源性激素的特異誘導(dǎo)，以期為研究哺乳動物著床“窗口期”母體的激素信號表達通路提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗選用ICR系雌性小鼠10只，8周齡，體重28 g左右。購自北京維通利華實驗動物科技有限公司【SCXK(京)2002－2003】。將10只母鼠隨機分為兩個組，每組五只:①PMSG處理組;②FSH處理組。根據(jù)PMSG和FSH在小鼠體內(nèi)的半衰期差異［3］，其劑量和間隔時間如下:①PMSG處理組:于實驗開始當天腹腔注射PMSG 10 IU/只(注射第1針計為0 h);②FSH處理組:實驗當天腹腔注射FSH 10 IU/只(注射第1針計時為0 h);12 h后腹腔注射FSH 10 IU/只;第24 h腹腔注射FSH 5 IU/只;第36 h腹腔注射FSH 5 IU/只。

1.2 實驗試劑

兔抗ERα單克隆抗體，購自Epitomics公司，貨號:1115－1;抗體稀釋液、羊抗兔SABC試劑盒、3，3－二氧基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢市博士德生物工程公司;磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.6)自配。

1.3 實驗儀器

倒置顯微鏡:Olympus公司，BX51;普通光學(xué)顯微鏡:Nikon，YS2－H;石蠟切片機:上海萊卡儀器有限公司，Leica RM 2126RT。

1.4 樣本采集

兩組小鼠均在PMSG或FSH處理第48小時頸部脫臼處死后取其卵巢、輸卵管、子宮，生理鹽水沖洗，4%的中性多聚甲醛4℃浸漬固定48～96 h。

1.5 免疫組化SABC法操作程序

①常規(guī)石蠟包埋、切片;②組織經(jīng)40℃水浴展片后，用APES處理的載玻片撈起，40℃過夜烘烤后脫蠟至水，3%H2O2室溫60 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS洗3次;③0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原熱修復(fù)，PBS洗3次;④5%BSA在37℃封閉40 min，甩去多余液體，不洗;⑤滴加兔抗ERα一抗(1∶50)，4℃過夜(12～14 h)，PBS洗3次;⑥生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育1 h，PBS洗4次;⑦滴加SABC 37℃40 m in，PBS洗4次;⑧DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒。取1 m L蒸餾水，依次加試劑盒中B、C、A試劑各50 μL，混勻后滴加至組織。根據(jù)顯色程度光鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌。⑨蘇木素復(fù)染3～5 s、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。

陰性對照以抗體稀釋液代替⑤中的一抗，其余步驟同上。

1.6 圖像分析

選取連續(xù)5張切片，每張片子隨機觀察5個視野，取5個視野的胞核陽性表達率(陽性胞核/細胞總胞核)均值，并采用Motic圖片分析系統(tǒng)分析其平均吸光度。卵巢根據(jù)卵泡的發(fā)育水平，分析系統(tǒng)計數(shù)各級卵泡免疫組化陽性細胞數(shù)量和平均吸光度;輸卵管采取整張切片計數(shù);子宮內(nèi)膜細胞按照子宮腺上皮細胞、子宮內(nèi)膜上皮細胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞三種細胞類型分別計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件單因素方差，Duncan檢驗分析，數(shù)據(jù)相關(guān)分析結(jié)果采用平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)PM SG或FSH處理的小鼠子宮、卵巢、輸卵管中ERα的表達分布

免疫組化染色陽性切片背景經(jīng)蘇木素復(fù)染為淡藍色，ERα免疫反應(yīng)的細胞為棕黃色;陰性對照組切片為淡藍色，無棕黃色染色，說明免疫組化SABC法具有ERα免疫反應(yīng)的特異性(圖1，彩插5)。

2.2 PM SG和FSH處理的小鼠其ERα在卵巢、輸卵管和子宮內(nèi)膜中的定位與表達差異

經(jīng)PMSG處理組的卵巢其初級卵泡和成熟卵泡的中ERα胞核的陽性率顯著高于FSH處理組(P＜0.05)，但在原始卵泡和次級卵泡中差異無顯著性(P＞0.05)，PMSG處理組初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡的平均吸光度均顯著高于FSH處理組(P＜0.05);輸卵管中FSH處理組的陽性率(0.154± 0.06)和平均吸光度(0.664±0.11)均顯著高于PMSG處理組的陽性率(0.100±0.04)和平均吸光度(0.418±0.08)(P＜0.05);FSH處理組的子宮基質(zhì)和腺體的陽性率顯著高于PMSG處理組(P＜0.05)，而FSH處理組基質(zhì)中ERα的平均吸光度顯著高于PMSG組(P＜0.05)。(表1、表2)。

表1 兩個處理組卵巢中各級卵泡的ERα胞核陽性率和平均吸光度的變化(±s)Tab.1 The expression intensity and average optical density of ERα in the ovarian follicles(±s)

表1 兩個處理組卵巢中各級卵泡的ERα胞核陽性率和平均吸光度的變化(±s)Tab.1 The expression intensity and average optical density of ERα in the ovarian follicles(±s)

注:上標相同字母表示差異無顯著性(P＞0.05)，字母不相同表示差異有顯著性(P＜0.05)。Note:The same letters indicate no significant differences among them(P＞0.05)，the different letters indicate a significant difference among them(P＜0.05).

組別Group原始卵泡Primordial follicle初級卵泡Primary follicle次級卵泡Secondary follicle成熟卵泡Mature follicle陽性率Positive rate平均吸光度Average optical density陽性率Positive rate平均吸光度Average optical density陽性率Positive rate平均吸光度Average optical density陽性率Positive rate平均吸光度Average optical density PMSG 0.186±0.02a0.657±0.07a0.275±0.03a0.797±0.05a0.253±0.05a0.841±0.06a0.392±0.06a0.768±0.01aFSH 0.171±0.02a0.600±0.06a0.230±0.04b0.720±0.05b0.209±0.04a0.733±0.05b0.318±0.04b0.714±0.01b

表2 兩個處理組子宮基質(zhì)、內(nèi)膜上皮、腺上皮的ERα胞核陽性率和平均吸光度的變化(±s)Tab.2 The expression intensity and average optical of ERα in the endometrial stroma，luminal epithelium and glandular epithelium of mouse uterus(±s)

表2 兩個處理組子宮基質(zhì)、內(nèi)膜上皮、腺上皮的ERα胞核陽性率和平均吸光度的變化(±s)Tab.2 The expression intensity and average optical of ERα in the endometrial stroma，luminal epithelium and glandular epithelium of mouse uterus(±s)

注:上標相同字母表示差異無顯著性(P＞0.05)，字母不相同表示差異有顯著性(P＜0.05)。Note:The same letters indicate no significant differences among them(P＞0.05)，the different letters indicate a significant difference among them(P＜0.05).

組別Group基質(zhì)Endomertrial stroma內(nèi)膜上皮Lum inal epithelium腺上皮Glandular epithelium陽性率Positive rate平均吸光度Average optical density陽性率Positive rate平均吸光度Average optical density陽性率Positive rate平均吸光度Average optical density PMSG 0.285±0.10a0.554±0.08a0.486±0.03a0.595±0.01a0.869±0.03a0.552±0.01aFSH 0.545±0.13b0.466±0.07b0.660±0.01a0.487±0.01a0.919±0.03b0.618±0.01a

3 討論

雌激素(estrogen)是與動物繁殖密切相關(guān)的生殖激素。雌激素在雌性動物的不同組織器官都有一定的生理作用:作用于卵巢，可以刺激卵泡發(fā)育;在輸卵管增生期，上皮細胞的有絲分裂明顯增加，纖毛增加，內(nèi)膜變厚［12］;接近排卵時，雌激素可增加輸卵管峽部平滑肌的活性，由輸卵管平滑肌和纖毛協(xié)同作用將受精卵送入子宮腔［13－15］;作用于子宮，刺激子宮管狀腺長度增加，黏液分泌增加，肌肉層增厚，蠕動增強。子宮在雌激素的作用下可以與孕酮協(xié)同作用使子宮處于接受態(tài)，這是胚胎植入的重要前提［16］。雌激素是通過其受體ER發(fā)揮作用的，雌激素受體未與雌激素結(jié)合時，結(jié)合熱休克蛋白，此時無活性;當遇到雌激素時，ER與熱休克蛋白解離，與雌激素結(jié)合而產(chǎn)生生理功能［3］。與熱休克蛋白結(jié)合的雌激素受體不能被檢測到，因此對雌激素受體的檢測在很大程度上可以反映出雌激素對組織的作用。本實驗中兩個處理組的卵巢、輸卵管和子宮中均有ERα信號相對波動表達，說明同期發(fā)情使雌激素產(chǎn)量動態(tài)變化，從而調(diào)節(jié)ERα的表達，這與潘永苗［7］和Halachm i等［17］研究結(jié)果一致。由于PMSG半衰期較長(40～125 h)，在體內(nèi)不易被及時清除，殘存的PMSG會影響卵泡的成熟和排卵，產(chǎn)生大卵泡并持續(xù)分泌雌激素［18］，本實驗研究表明經(jīng)PMSG處理組，卵巢中初級卵泡和成熟卵泡ERα的分布均顯著高于FSH處理組(P＜0.05)，其平均吸光度顯示PMSG處理組的初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡中信號強度顯著高于FSH組(P＜0.05)，表明這些時期由PMSG誘導(dǎo)的雌激素分泌顯著高于由FSH所誘導(dǎo)的分泌結(jié)果。由于原始卵泡的活動尚不活躍，其激素的活性波動不大，而初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡中的激素變化可能由于PMSG的長效作用而發(fā)生顯著的增加。在輸卵管中，ERα在FSH組的陽性率顯著高于PMSG組(P＜0.05)，雌激素的分布影響了輸送卵母細胞和受精的效率，由于FSH的多次注射有效調(diào)節(jié)了雌激素的分泌曲線最終調(diào)節(jié)了ERα的相對分布，可以彌補其半衰期較短的缺陷。子宮中FSH組基質(zhì)和腺上皮中ERα的表達顯著高于PMSG組(P＜0.05)，而子宮內(nèi)膜上皮細胞的陽性率兩處理組間差異無顯著性，由此可以看出:雌激素對子宮腺上皮和間質(zhì)中的ERα調(diào)節(jié)反饋更迅速，這與Kuiper［19］和Jonna［20］的結(jié)果相同，子宮內(nèi)膜上皮是與胚胎發(fā)生直接聯(lián)系的部位，它的穩(wěn)定性尤為重要，如果對體內(nèi)激素的變化反應(yīng)過于強烈可能對胚胎產(chǎn)生不利的影響。

在此實驗中，PMSG和FSH對小鼠同期發(fā)情處理均不同程度影響了其卵巢、輸卵管和子宮中的ERα分布，這種影響是由內(nèi)源性雌激素的變化引起的，與同期發(fā)情效果密切相關(guān)。PMSG作為長效激素對于卵巢中卵泡的ERα的調(diào)節(jié)作用更為顯著，在用FSH作為小鼠超排藥物時，需要多次注射才能維持小鼠的輸卵管中ERα的分布。但這兩種激素的作用，特別是在其后對受精前卵母細胞的生長和運輸，以及受精等關(guān)鍵時期中的作用和探討對大家畜人工輔助生殖中的潛在影響，尚待進一步的研究。

(本文圖1見彩插5。)

［1］Wang HB，Dey SK.Roadmap to embryo implantation:clues from mouse models［J］.Nature Reviews Genetics，2006，7:185－199.

［2］李萍.體外受精－胚胎移植中胚胎著床的相關(guān)性研究［J］.中國計劃生育學(xué)雜志，2006，8(130):504－506.

［3］楊增明，孫青原，夏國良.生殖生物學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社出版，2005，410.

［4］Schoolcraft W，Lane M，Stevens J，et al.Increased hyaluronan concentration in the embryo transfer medium results in a significant increase in human embryo implantation rate［J］.Fertil Steril，2002，14:S5.

［5］Wang Y，Wang F，Sun T，et al.Entire mitogen activated protein kinase(MAPK)pathway is present in preimplantation mouse embryos［J］.Dev Dyn，2004，231:72－87.

［6］Dey SK，Lim H，Sanjoy K，et al.Molecular cues to imp lantation［J］.Endocr Rev，2004，25:341－373.

［7］潘永苗，石一復(fù).GnRHa超排卵對小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)和雌、孕激素受體表達的影響［J］.生殖與避孕，2002，22.

［8］吳建云，田茂春，王鮮忠，等.雌激素受體α在雌性大鼠腦中的表達［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2009，29(11):1489－1493.

［9］唐成和，楊留才，臧宜平.雌激素相關(guān)受體α在胃腺癌中表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(40):64－65.

［10］周智君，俞遠京，丁志剛，等.大豆異黃酮對老齡大鼠雌激素水平和子宮雌激素受體表達的影響［J］.中國實驗動物學(xué)報，2009，17(4):288－291.

［11］張鴻波，秦國嵩，劉云海，等.雌激素和孕激素對不同發(fā)情方式小鼠子宮內(nèi)膜中孕激素受體分布的影響［J］.中國實驗動物學(xué)報，2009，17(3):206－209.

［12］徐晨，周作民.生殖生物學(xué)理論與實踐［M］.第一版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)文獻出版社，2005，171.

［13］戴鐘英.異位妊娠的病因、早期診斷和治療研究的進展［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，1992，27(6):373－376.

［14］Matthews CP，Coulson PB，W ild RA.Serum progesterone levels as an aid in the diagnosis of ectopic pregnancy［J］.Obstet Gynecol，1986，68:390－394.

［15］陸奎春.孕激素受體的研究進展［J］，國外醫(yī)學(xué)計劃生育分冊，1996，15(4):218.

［16］趙興緒.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)［M］.第三版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002，29.

［17］Halachmi S，Marden E，Martin G，et al.Estrogen receptorassociated proteins:possible mediators of hormone－induced transcription［J］.Science，1994，264:1455－1458.

［18］徐晨，周作民.生殖生物學(xué)理論與實踐［M］.上?？茖W(xué)技術(shù)文獻出版社，2005，171.

［19］Kuiper GG，Carlsson B，Grandien K，et al.Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors α and β［J］.Endocrinology，1997，138:863－870.

［20］Frasor J，Barnett DH，Danes JM.Response－specific and ligand dose－dependent modulation of estrogen receptor(ER)α activity by ERβ in the uterus［J］.Endocrinology，2003，144(7):3159－3166.

Effect of Estrus Synchronization with PMSG and FSH on the Distribution of Estrogen Receptor α in the Mouse Uterus，Ovary and Fallopian Tube

LIN Zi－li1，GAO Ya1，DENG Gui－xin1，LIANG Hong－bin1，ZHANG Hong－bo1，LIU Yun－h(huán)ai1，NI He－min1，GUO Yong1，WANG Zhi－gang2

(1.Department of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China; 2.National Animal Husbandry Service of the Ministry of Agriculture，Beijing 100125)

ObjectiveTo investigate the distribution of estrogen receptor α(ERα)in the ovary，fallopian tube and uterus between the mouse treated by estrus synchronization with PMSG and FSH.MethodsAccording to the different treatments，in total 10 ICR mice were divided into two groups:the PMSG FSH treatment groups.At 48 h after the injection of hormones，the ovaries，oviducts and uterus were taken and fixed in paraformaldehyde.Immunohistochemical staining was used to observe and analyze the distribution of ERα in these tissues.ResultsThe positively stained cell number and average optical density in the primary ovarian follicles and matured follicles of the PMSG treatment group were significantly higher than those of the FSH one(P＜0.05).The positively stained cell number and average optical density in the oviduct of the FSH treatment group was significantly higher than those of the PMSG one(P＜0.05).In the uterine stroma and glandular epithelium，the positively stained cell number of the FSH treatment group was significantly higher than that in thePMSG group(P＜0.05)，but the positive rate and average optical density between two treatment groups was not significantly different(P＞0.05).ConlusionPMSG and FSH may affect on the distribution of ERα in mouse ovary，oviduct and uterus to a varying degree，and lead to a differential ERα expression in those tissues.

Mouse;Ovary;Oviduct，Uterus;Distribution of estrogen receptor α

R321－33

A

1005－4847(2010)03－0204－04

2010－2－24

2009年度北京市自然基金重點項目“胚胎滋養(yǎng)層干細胞的功能性分析”(項目批準號:5091002);國家“十一五“863計劃”重點項目“家畜卵泡高效誘導(dǎo)發(fā)育技術(shù)研究與應(yīng)用”(項目批準號:2008AA101003);國家“十一五科技支撐計劃”項目“肉羊高效育種關(guān)鍵技術(shù)的研究與應(yīng)用”(項目批準號:2008BADB2B04－4)。

林自力(1984－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:動物產(chǎn)科及胚胎工程，E－mail:talzl@163.com

王志剛，男，研究員;研究方向:動物遺傳育種，E－mail:talzl@163.cn