呂建敏，劉月環(huán)

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053;

2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物中心，杭州 310013)

研究報(bào)告

日本大耳白黑眼兔在不同生長(zhǎng)階段蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)與肝臟相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系

呂建敏1，劉月環(huán)2

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053;

2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物中心，杭州 310013)

目的研究日糧粗蛋白水平和生長(zhǎng)階段對(duì)日本大耳白黑眼兔(WHBE兔)肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法采用兩因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別選取斷奶和2月齡WHBE兔各20只進(jìn)行為期1個(gè)月的幼兔期和育成兔期飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)階段實(shí)驗(yàn)均將兔隨機(jī)分為5組，各組日糧粗蛋白水平分別為12%、14%、16%、18%和20%，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定肝臟胰島素樣生長(zhǎng)因子－1(IGF-1)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶－C(PEPCK-C)的mRNA的表達(dá)豐度。結(jié)果生長(zhǎng)階段和粗蛋白水平均對(duì)WHBE兔肝臟IGF-1mRNA的表達(dá)豐度有顯著影響，育成兔期IGF-1 mRNA的表達(dá)豐度明顯高于幼兔期;日糧粗蛋白水平為16%和18%時(shí)IGF-1mRNA表達(dá)豐度較高，顯著高于其他3組。PEPCK-C mRNA的表達(dá)也以16%粗蛋白組最高，幼兔期和育成兔期之間差異無(wú)顯著性。結(jié)論日糧粗蛋白水平對(duì)IGF-1和PEPCK-C基因表達(dá)有顯著影響，生長(zhǎng)階段與IGF-1mRNA表達(dá)密切相關(guān)。

日糧;粗蛋白;生長(zhǎng)階段;WHBE兔;基因表達(dá)

圖2 IGF-I、PEPCK-C和GADPH cDNA real-time PCR 產(chǎn)物的熔解曲線Fig.2Melting curve analysis of IGF-I, PEPCK-C and GADPH real-time PCR amPlified Products

生物技術(shù)的飛速發(fā)展為營(yíng)養(yǎng)學(xué)的深入研究提供了有力的保障，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，可以使人們從分子水平去認(rèn)識(shí)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用機(jī)制，不僅能更準(zhǔn)確地判斷動(dòng)物對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的精確需要量，而且能深刻揭示它們的作用機(jī)理。近年來對(duì)營(yíng)養(yǎng)與基因相互關(guān)系的研究已逐漸為人們所重視，主要體現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)調(diào)控代謝的相關(guān)酶和激素的基因表達(dá)影響研究。日本大耳白黑眼兔(WHBE兔)是浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心培育的實(shí)驗(yàn)兔新品系，研究WHBE兔營(yíng)養(yǎng)需要和相關(guān)功能基因表達(dá)關(guān)系，對(duì)于制定相應(yīng)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，合理配制日糧，完善WHBE兔的系統(tǒng)研究具有積極作用。本文從蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)入手，選取了與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的兩種基因肝臟胰島素樣生長(zhǎng)因子－1(IGF-I)mRNA和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶－C(PEPCK-C)mRNA，利用熒光定量PCR技術(shù)，研究不同日糧粗蛋白水平對(duì)WHBE兔肝臟IGF-I mRNA和PEPCK mRNA表達(dá)豐度的影響，以期從分子水平上得到不同生長(zhǎng)階段的WHBE兔對(duì)日糧粗蛋白的精確需要量，同時(shí)為蛋白質(zhì)需要研究方法提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

斷奶和2月齡雄性WHBE兔各20只，體質(zhì)量分別為800～1000 g和2000～2200 g，來源于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心【SCXK(浙)2005－0022】，用于幼兔和和育成兔的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。每階段兔均飼養(yǎng)30 d，實(shí)驗(yàn)在浙江中藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心進(jìn)行【SYXK(浙)2003－0004】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

將幼兔和育成兔均隨機(jī)分為5組，每組4只，分別飼喂含12%、14%、16%、18%和20%粗蛋白的日糧，各組飼料配方和營(yíng)養(yǎng)水平見表1和表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死動(dòng)物，迅速采集肝臟樣本，液氮冷凍，待實(shí)驗(yàn)室分析用。

1.2 肝臟IGF-I和PEPCK-C基因表達(dá)分析

1.2.1 肝細(xì)胞總RNA的提取

(1)將肝臟組織在液氮中磨成粉末后，再以50～100 mg組織加入1 m L Trizol液研磨，樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。

(2)研磨液室溫放置5 min，然后以每1 m L Trizol液加入0.2 m L的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 s。

(3)取上層水相于一新的離心管，按每m L Trizol液加0.5 m L異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 min，12 000 g離心10 min。

表1 日糧配方(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Composition of the experimental diets(air dry basis)

表2 日糧營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.2 Nutrient levels of the experimental diets(air－dry basis)

(4)棄去上清液，按每m L Trizol液加入至少1 mL的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500 g離心5 m in。

(5)小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5～10 min，注意不要干燥過分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于無(wú)酶水中。

(6)使用核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度，并根據(jù)A260/280值判斷RNA的質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)所用樣本都在1.8～2.0之間。

1.2.2 肝細(xì)胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄:按Takara反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成:IGF-I和PEPCK-C的引物根據(jù)NCBI上登錄的兔IGF-I序列(OCU75390)和PEPCK-C片段序列(EF616471)設(shè)計(jì)合成。內(nèi)參GADPH的引物根據(jù)NCBI登錄的兔GADPH序列(NM:001082253)設(shè)計(jì)合成。所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。見表3。

表3 IGF-I，PEPCK-C及GADPH的PCR引物序列表Tab.3 The PCR primers for IGF-I，PEPCK-C and GADPH

1.2.4 cDNA的熒光定量PCR:以SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立20 μL反應(yīng)體系，包括SYBR Green I熒光染料預(yù)混試劑10 μL、ROXⅡ0.4 μL、上游和下游引物(20 μmol/L)各0.25 μL、cDNA模板1 μL和雙蒸去離子水8.1 μL。反應(yīng)條件:①94℃預(yù)變性15 s;②94℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s并采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán);③按儀器操作說明選擇熔解曲線分析，60℃升至94℃，60℃保溫1 min、94℃保溫15 s，自動(dòng)采集熒光。所用儀器為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的7500型real－time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

將mRNA表達(dá)量最低的一組(12%粗蛋白組)作為參照(對(duì)照組)。經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因均一化處理后，通過2－△△CT方法計(jì)算，目標(biāo)基因表達(dá)差異通過其他粗蛋白水平組樣本相對(duì)于對(duì)照組的樣本的倍數(shù)來表示。即對(duì)于除對(duì)照組以外粗蛋白水平組的樣本，相對(duì)于參照樣本的基因表達(dá)倍數(shù)為2－△△CT。

采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件(1997)廣義線性模型(GLM)進(jìn)行兩因素方差分析和顯著性比較，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果和分析

2.1 PCR產(chǎn)物電泳圖及熔解曲線

由PCR產(chǎn)物的電泳圖(圖1)可見，目的基因(IGF-I和PEPCK-C)的片段和參比基因(GADPH)的片段大小都與設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小一致。Real－time PCR產(chǎn)物的熔解曲線見(圖2，彩插6)，IGF-1、PEPCK-C和GADPH熔解的Tm溫度分別為89.3℃，87.7℃和84.8℃，其擴(kuò)增片段的特異性峰表明引物設(shè)計(jì)與反應(yīng)條件均適用于此定量PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列分析結(jié)果與GenBank中兔IGF-I，PEPCK-C的相應(yīng)區(qū)域的同源性在98%以上，由此可以確認(rèn)擴(kuò)增所得序列片段即為目的基因序列。

圖1 IGF-I、PEPCK-C和GADPH cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of IGF-I，PEPCK-C and GADPH cDNA

2.2 肝臟IGF-I和PEPCK-C基因表達(dá)

幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟IGF-I mRNA和PEPCK-C mRNA表達(dá)結(jié)果見表4。

由表4可知，幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟IGF-I的基因表達(dá)豐度以16%和18%粗蛋白組最高，與其他3組差異有顯著性(P﹤0.05)。不同生長(zhǎng)階段WHBE兔的肝臟IGF-Ⅰ基因表達(dá)存在顯著差異，育成兔期明顯高于生長(zhǎng)期(P﹤0.05)。幼兔期和育成兔期WHBE兔PEPCK-C mRNA的表達(dá)隨著日糧粗蛋白水平的變化趨勢(shì)基本與IGF-I mRNA表達(dá)一致，以16%粗蛋白組最高，與12%粗蛋白組差異有顯著性(P＜0.05)，但幼兔期和育成兔期間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

3 討論與結(jié)論

胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)是下丘腦－垂體－靶器官生長(zhǎng)軸的終端，是生長(zhǎng)激素啟動(dòng)生長(zhǎng)活性的主要介導(dǎo)者，不僅反映動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)狀況，而且對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能的維持可能具有重要意義［2］。Lemonzy等(1994)［3］發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)缺乏會(huì)導(dǎo)致大鼠肝、腎組織IGF-I mRNA表達(dá)下降。Kanamoto等(1994)［4］研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量均能影響大鼠肝組織IGF-I mRNA表達(dá)。Fukada等(2004)［5］和Pedroso等(2006)［6］在有關(guān)魚類的實(shí)驗(yàn)中，都發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)水平的提高可以提高IGF-I的基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在16%、18%粗蛋白水平下幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟IGF-I mRNA表達(dá)峰度均高于其他水平，且12%粗蛋白水平下表達(dá)量最小，這與前人的研究結(jié)果一致。由于肝臟中IGF-I mRNA變化會(huì)直接影響血漿中IGF-I濃含量［7］，McMurtry等(1997)［8］發(fā)現(xiàn)成年家禽血清中IGF-I含量要明顯高于幼年家禽，本研究也發(fā)現(xiàn)，育成兔期WHBE兔IGF-1的基因表達(dá)豐度顯著高于幼兔期，其原因還有待進(jìn)一步研究。

表4 幼兔期和育成兔期WHBE兔IGF-1和PEPCK-C基因表達(dá)豐度Tab.4 The expression abundance of IGF-1 mRNA and PEPCK-C mRNA during growing and finishing periods

PEPCK-C是糖異生作用的關(guān)鍵酶之一，PEPCK-C的酶活性與其mRNA的表達(dá)量呈顯著相關(guān)。Lemaigre等(1994)［9］研究發(fā)現(xiàn)禁食或糖尿病會(huì)顯著提高PEPCK的活性。Kirchner等(2003)［10］報(bào)道，日糧蛋白水平也會(huì)影響到肝臟PEPCK mRNA的表達(dá)，蛋白質(zhì)采食量過低引起虹鱒魚體內(nèi)糖異生酶的基因表達(dá)水平的下降。陳偉健(2008)［11］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)飼適量的菜粕，可明顯提高湖羊肝臟PEPCK-C mRNA表達(dá)峰度，而過高蛋白補(bǔ)飼量則使表達(dá)峰度降低。從本研究結(jié)果看，幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟PEPCK-C mRNA的表達(dá)量都是在16%粗蛋白水平下達(dá)到最高，在12%粗蛋白水平下最低，且差異顯著。這表明，適當(dāng)?shù)牡鞍谞I(yíng)養(yǎng)水平可以提高肝臟中PEPCK-C的基因表達(dá)量，但是水平過高的將失去這種作用。

綜上所述，日糧粗蛋白水平對(duì)WHBE兔肝臟的IGF-1和PEPCK-C的基因表達(dá)均有顯著影響，在16%～18%粗蛋白水平下表達(dá)豐度最大;育成兔期WHBE兔IGF-1的基因表達(dá)明顯高于幼兔期;幼兔期和育成兔期WHBE兔的日糧適宜粗蛋白水平應(yīng)在16%～18%。

結(jié)果表明，IGF-1和PEPCK基因都與日糧粗蛋白水平密切相關(guān)，表達(dá)豐度與日糧粗蛋白水平的變化趨勢(shì)較一致，本研究同時(shí)為今后準(zhǔn)確確定兔日糧粗蛋白水平提供了檢測(cè)依據(jù)。

(本文圖2見彩插6。)

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Relationship of Dietary Crude Protein and G row th Stages w ith the Expression of Hepatic Functional Genes in WHBE Rabbits

LV Jian－min1，LIU Yue－h(huán)uan2
(1.Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China; 2.Zhejiang Center of Laboratory Animals，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China)

ObjectiveTo evaluate the effects of dietary crude protein(CP)level on hepatic functional genes expression during the growing and finishing periods in WHBE rabbits.M ethods Twenty rabbits were used in each stage according to a two－way trail.The rabbits in both periods were divided into five equal groups and fed with the diets of equal digestible energy but different CP contents(12%，14%，16%，18%and 20%).After a one－month feeding trail，the expression abundance of hepatic IGF-1 and PEPCK-C genes in the rabbits was determined by real－time PCR.Results The growth stages had significant effect on hepatic IGF-I mRNA expression，with a higher expression abundance in the finishing period，compared with that in the growth period.The IGF-I gene expression abundance was higher in rabbits receiving 16% or 18%CP than that of lower CP levels.Hepatic PEPCK-C mRNA was also highest at 16%CP level，but there were no significant differences between growing and finishing periods.ConlusionThere is a significant relationship between the expression of the two genes and dietary CP.The expression of IGF-I mRNA，but not PEPCK–C mRNA，is closely related to different growth stages.

Diet;Crude protein;Grow th stage;WHBE rabbit;Gene expression

R－33

A

1005－4847(2010)03－0208－04

2009－10－12

浙江省科技廳資助項(xiàng)目(2008F80003);浙江省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(2006A94)。

呂建敏(1971－)，女，副研究員，博士，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫方面的科研工作。E－mail:jiaminvv@yahoo.com.cn

劉月環(huán)(1974－)，女，副研究員，碩士，研究方向:生物技術(shù)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種.。E－mail:yuehuanliu@163.com