成鋼，蓋楠，熊德慧，胡維新

(中南大學生物科學與技術學院分子生物學研究中心，長沙 410078)

研究報告

東方田鼠胚胎成纖維細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性

成鋼，蓋楠，熊德慧，胡維新

(中南大學生物科學與技術學院分子生物學研究中心，長沙 410078)

目的對影響東方田鼠胚胎成纖維細胞(M fEF)分離和培養(yǎng)的因素進行探索，并觀察其生物學特性。方法取室內繁殖飼養(yǎng)不同胎齡的東方田鼠胚胎分離成纖維細胞，通過原代和繼代培養(yǎng)，分析比較不同胎齡、不同血清濃度、不同胰蛋白酶濃度等因素對M fEF分離及培養(yǎng)的影響，觀察M fEF的生長形態(tài)及其生物學特性。結果

M fEF為貼壁型生長，細胞形態(tài)多樣，呈梭形、不規(guī)則多邊形;采用0.125%的胰蛋白酶室溫消化12～13 d胚胎組織5 min，以DMEM培養(yǎng)基添加15%小牛血清分離培養(yǎng)M fEF的效果最佳;M fEF2～7代增殖最旺盛。結論獲得了實驗室分離、培養(yǎng)M fEF的有效方法，為進一步深入研究東方田鼠抗日本血吸蟲機制以及開展不同動物成纖維細胞間比較研究奠定了基礎。

東方田鼠;胚胎成纖維細胞;生物學特性

A. 0.125%胰酶消化分離的原代12 d MF胎兒MfEF;B. 12 d MF胎兒原代組織塊培養(yǎng)第6 天;C. 12 d MF胎兒第3代MfEF培養(yǎng)48 h;D. 12 d MF胎兒MfEF培養(yǎng)第9代;E. MfEF第3代,HE染色;F. 復蘇的第3代MfEF培養(yǎng)72 h。圖1MfEF生長形態(tài)A. MfEF isolated by 0.125% tryPsin from day 12 embryo; B. MfEF cultured from day 12 embryo tissue for 6 d; C. The 3rd Passage MfEF isolated from a day 12 embryo and cultured for 48 h; D. The 9th Passage MfEF isolated from a d12 embryo; E. 3rd Passage MfEF, HE staining; F. The recovered MfEF were cultured for 72 h.Fig.1The morPhology of Microtus fortis embryonic fibroblasts at different growth stages

東方田鼠(Microtus fortis，M f)是我國日本血吸蟲病流行區(qū)洞庭湖湖州廣泛分布的一種優(yōu)勢鼠種，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一對日本血吸蟲病有天然抗性的嚙齒類哺乳動物［1］。從60年代初發(fā)現(xiàn)M f可抗日本血吸蟲感染到目前人們對M f展開廣泛深入的研究已近50年，但至今還沒有相關M f細胞系的報道。胚胎成纖維細胞是相對容易培養(yǎng)的細胞系，用途廣泛。建立M f胚胎成纖維細胞(Microtus fortis embryonic fibroblasts，M fEF)系，是尋求M f發(fā)揮抗日本血吸蟲作用的重要基礎，不僅可以緩解試驗用M f的不足，而且還能深入挖掘和利用我國特有的物種遺傳資源。目前，對小鼠和人胚胎成纖維細胞相關研究較多［2～5］，M fEF的分離和培養(yǎng)尚為首次報道。M fEF有何生物學特性，是否與抗日本血吸蟲作用相關，與人和小鼠胚胎成纖維細胞分離培養(yǎng)有何異同等都值得深入研究。本研究探討了影響實驗室M fEF分離和培養(yǎng)的因素，并對M fEF的生物學特性進行研究探索，為實驗室分離培養(yǎng)M fEF細胞和深入研究M f抗日本血吸蟲機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胚胎來源:20周齡(70～80 g)懷孕東方田鼠(長江亞種人工封閉繁育第3代)，中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物學部提供。

1.1.2 主要試劑:胰蛋白酶(上海生工有限公司)，DMEM(低糖)培養(yǎng)基(invitrogen公司)，新生牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程有限公司)，青霉素、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司;臺盼藍(Sigma公司)，其余常用試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 原代M fEF的培養(yǎng):取妊娠6～7 d、12～13 d的孕鼠，乙醚麻醉后無菌取出子宮，用PBS漂洗3次，棄除表面血污，剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，用鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，剔除胎盤、胚頭、內臟和四肢，無菌PBS漂洗3次，剔除可能附帶的脂肪組織、被膜結締組織、壞死組織以及紅細胞，將鼠胚軀干剪成約1 mm3的碎塊，放入離心管后用培養(yǎng)液反復吹打，靜置沉淀5 min，吸取上清于培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，沉淀的組織塊分別采用組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化法在含15%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素的DMEM，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，實時觀察記錄不同培養(yǎng)方法細胞的狀態(tài)。

1.2.2 繼代M fEF的培養(yǎng):原代M fEF鋪滿培養(yǎng)瓶的80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 不同胎齡胚胎對分離M fEF的影響:分別對6～7 d、12～13 d胎齡的M f分離培養(yǎng)成纖維細胞，觀察不同胎齡細胞的生長狀況及增殖情況。

1.2.4 不同血清濃度對M fEF生長的影響:取12～13 d胎兒的第3代M fEF接種至48孔板，每孔接種10 000個細胞，分別以10%和15%不同濃度血清培養(yǎng)，每種濃度重復3孔，用血球計數板每天計數取平均值，連續(xù)7 d，繪制細胞生長標準曲線。

1.2.5 傳代次數對M fEF生長及傳代的影響:對不同胎齡的M fEF原代培養(yǎng)成功后，進行繼代培養(yǎng)，對傳代次數，細胞形態(tài)變化等進行記錄，照相和HE染色。

1.2.6 不同胰蛋白酶濃度對分離M fEF的影響:選擇0.125%和0.25%不同濃度的胰蛋白酶在室溫條件下消化12～13 d胎兒組織，觀察不同酶濃度和消化時間對分離原代M fEF的影響。

1.2.7 M fEF的凍存與復蘇:采用凍存體系分別為90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO及90%血清+10%甘油，按常規(guī)凍存程序凍存第2和第3代M fEF，凍存2周后取出細胞復蘇培養(yǎng)，臺盼藍染色計算細胞活率。

1.2.8 M fEF培養(yǎng)上清殺傷日本血吸蟲童蟲實驗: M fEF長滿培養(yǎng)瓶95%時，無菌收獲第3和第4代M fEF培養(yǎng)液，2000 r/min離心10 min，取上清，以50%的濃度加到含脫尾尾蚴的24孔培養(yǎng)板中，尾蚴每孔100±20尾，每個樣本設立平行三孔，20%濃度的M f血清為陽性對照，以小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3培養(yǎng)上清為陰性對照，于37℃、5%CO2培養(yǎng)，96 h內作連續(xù)體外殺傷日本血吸蟲童蟲效果觀察。

2 結果

2.1 M fEF生長形態(tài)觀察

M fEF在體外為貼壁生長型細胞，原代培養(yǎng)細胞體積較小(圖1，A)，雜細胞較多，培養(yǎng)12 h后部分細胞開始貼壁，48h后大部分細胞仍懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁細胞胞質向兩端伸出偽足呈長梭形，細胞體積逐漸增大，邊界清晰，立體感強，呈火焰狀、漩渦狀排列生長(圖1，B)，隨著培養(yǎng)時間的延長，胞質向培養(yǎng)瓶底部鋪展，細胞間界限模糊，無立體感，折光性強。M fEF繼代培養(yǎng)貼壁性能極佳，傳代1 h后即可牢固貼壁，傳代3次后可得到較純凈的M fEF(圖1，C)，HE染色M fEF胞核大呈橢圓形，約占細胞體積的三分之一(圖1，E)。圖1見彩插8。

2.2 不同胎齡對分離M fEF的影響

實驗比較了6～7 d和12～13 d胎齡對分離培養(yǎng)M fEF的影響，6～7 d M f的胚胎(每胚約0.1 g)，組織柔嫩，采用剪碎后機械吹打即可獲得單細胞懸液，不必使用胰酶消化，但原代細胞長滿培養(yǎng)瓶需要7 d以上;12～13 d胎齡胚胎(每胚約0.4 g)宜采用胰酶消化，細胞培養(yǎng)4 d后即可傳代培養(yǎng)，細胞數量多，純度好(圖1，A)。對不同胎齡胚胎組織，采用組織塊貼壁法均可培養(yǎng)出M fEF(圖1，B)，細胞長滿培養(yǎng)瓶所需天數與胚胎日齡呈反比。

2.3 不同血清濃度對M fEF生長的影響

在15%與10%血清濃度培養(yǎng)基中，M fEF分別在培養(yǎng)第2天和第3天進入指數增長期，培養(yǎng)第4、第5天達到生長高峰，隨培養(yǎng)時間延長細胞逐漸衰亡，數量迅速減少，二者均沒有穩(wěn)定的平臺期。實驗表明:10%和15%血清濃度的培養(yǎng)基均可用于M fEF的培養(yǎng)，但前者M fEF增殖相對緩慢，15%血清濃度的培養(yǎng)基更適宜M fEF生長(圖2)。

2.4 傳代次數對M fEF生長的影響

對M fEF繼代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn):6～7 d胎齡胚胎2～5代增殖較為旺盛，約3～4 d即可傳代一次，從第6代起，細胞已不能隨著培養(yǎng)天數的增加而增殖;12～13 d胎齡胚胎2～7代增殖較為旺盛，第8代以后，細胞形態(tài)呈不規(guī)則多邊形，細胞內顆粒增多，細胞間黏度增大;傳至第9代時，細胞成簇疊加生長，細胞間界限模糊，胞質收縮，出現(xiàn)衰亡特征(圖1，D)。

2.5 不同胰蛋白酶濃度對分離M fEF的影響

本實驗分別采用0.125%和0.25%兩種濃度的胰蛋白酶在室溫條件下消化12～13 d M f胎兒組織后發(fā)現(xiàn):在組織量和消化時間均相同的情況下0.125%較0.25%胰蛋白酶分離的細胞密度大，活力好，貼壁細胞多，速度快，是實驗室分離M fEF合適的胰蛋白酶濃度(圖1，A)。

2.6 M fEF的凍存與復蘇

對10%DMSO和10%甘油凍存2周后的第2、第3代M fEF分別進行復蘇培養(yǎng)，臺盼藍染色細胞活率均達90%以上，鏡下觀察，細胞不著色，折光性強，形態(tài)完整。接種培養(yǎng)后4 h開始貼壁，24 h后呈典型的M fEF形態(tài)，兩種凍存體系在細胞活率、貼壁時間、傳代時間等指標沒有明顯差別，都適用于M fEF的凍存(圖1，F(xiàn))。

2.7 M fEF培養(yǎng)基殺傷日本血吸蟲童蟲

第3和第4代M fEF培養(yǎng)上清液與日本血吸蟲童蟲共培養(yǎng)96 h后，童蟲死亡率分別達到15.1%和 13.3%，與小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3培養(yǎng)上清和陽性對照的童蟲死亡率9.3%與45.6%相比沒有明顯的殺傷效果(圖3)。

圖2 不同血清濃度對M fEF生長的影響Fig.2 Influence of different serum concentrations on the growth of M fEF

圖3 M fEF培養(yǎng)上清與童蟲共培養(yǎng)96 h后減蟲率Fig.3 The killing effect of M fEF culture supernatant on the co－cultured schistosomulum for 96 h

3 討論

通過對M fEF進行初步分離培養(yǎng)，并對M fEF的生物學特性進行觀察，發(fā)現(xiàn)與小鼠胚胎成纖維細胞特性許多不同。與小鼠相比M fEF維持傳代時間更長，而且傳代次數與M f胚胎胎齡相關，胎齡越小傳代次數越少，12～13 d胎齡胚胎可穩(wěn)定傳代8次以上;M fEF傳代1 h后即可牢固貼壁，用吸管吹打不易脫落;M fEF透光性較好，長滿培養(yǎng)瓶后鏡下觀察不易分辨細胞輪廓，以上特性可能由于M f與小鼠的染色體數目差別較大，種屬差異有關。已報道胚胎成纖維細胞可以向培養(yǎng)液中分泌成纖維細胞生長因子(fibroblast grow th factor，F(xiàn)GF)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)，胰島素樣生長因子結合蛋白－4(insulin－like growth factor－binding protein 4，IGFBP－4)，色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)等諸多蛋白成分，參與信號轉導、細胞外基質生成、轉錄調節(jié)、細胞分化與凋亡等作用［6］。基于以上考慮，我們把第3和第4代M fEF培養(yǎng)上清液與日本血吸蟲童蟲共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與陰性對照相比M fEF培養(yǎng)上清液對日本血吸蟲童蟲有一定的殺傷作用，但殺傷效果不顯著，以上結果與申群喜等［7］將日本血吸蟲童蟲與M f心臟、肝、肺、腎、脾和肌肉的勻漿上清液混合培養(yǎng)結果相一致，實驗提示M f抗日本血吸蟲作用的主效分子主要存在于血清中，應重點從M f血清中篩選抗性成分。M fEF系的建立可為M f的相關研究提供細胞、蛋白質、DNA、RNA樣本，與活體樣本相比，細胞系可以連續(xù)培養(yǎng)，反復凍存，便于管理和使用，而且不會因為個體遺傳差異和生理狀態(tài)影響實驗的可重復性，還可完成如蛋白質的亞細胞定位、轉基因、免疫熒光、RNA干擾等相關實驗。由于M fEF不能在體外長期培養(yǎng)，我們已展開對M fEF永生化篩選的工作，并已取得一定進展。

(本文圖1見彩插8。)

［1］劉杰生，容壽銘，陳佩璣，等.幾種鼠類人工感染日本血吸蟲的實驗觀察［J］.中國血吸蟲病防治雜志，1992，4(6): 350－351.

［2］Evans MJ，Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos［J］.Nature，1981，292(5819):156.

［3］劉民，李柏青.小鼠胚胎成纖維細胞的分離、擴增和抑制［J］.中國實驗動物學雜志，2002，12(4):215－219.

［4］常萬存，竇忠英，高志敏.人胚胎成纖維細胞的冷凍保存［J］.西北農業(yè)學報，2000，9(1):6－9.

［5］張怡，趙連三，汪成孝，等.人胚胎成纖維細胞與小鼠胚胎成纖維細胞生物學特性比較［J］.生物醫(yī)學工程學雜志，2003，20(2):251－254.

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［7］申群喜，胡維新，許冰，等.東方田鼠組織、器官體外殺日本血吸蟲童蟲作用［J］.湖南醫(yī)科大學學報，2002，27(3):198－200.

Isolation，Culture and Biological Characteristics of Em bryonic Fibroblasts from M icrotus fortis

CHENG Gang，GAI Nan，XIONG De－h(huán)ui，HU Wei－xin
(Molecular Biology Research Center，School of Biological Science and Technology，Central South University，Changsha 410078，China)

ObjectiveThe aim of this study was to isolate，culture，and characterize embryonic fibroblasts from Microtus fortis(M fEF).M ethods The primary embryonic fibroblasts were isolated from Microtus fortis fetus at different gestational ages.According to the influence of different serum and trypsin concentrations and different gestational ages，the growth behavior and the biological characteristics of M icrotus fortis embryonic fibroblasts(M fEF)were studied.ResultsThe M fEF in vitro appeared as adherent cells with good ability for proliferation in passages 2－7.The optimal gestational age for isolation of M fEF was from day 12 to 13.At the temperature of 20℃to 25℃，the optimal time for digestion of fetal tissue to obtain fibroblasts was 5 min with a digestion solution containing 0.125%of trypsin.The M fEF were cultured in DMEM(low glucose)supp lemented with 15%FBS.ConlusionEmbryonic fibroblasts of M icrotus fortis have been successfully isolated and cultured，which lay the foundation for further studies on Microtus fortis against Schistosma japonicum infection and for comparative study of fibroblasts between different animals.

M icrotus fortis;Embryonic fibroblasts;Biological characteristics

Q25

A

1005－4847(2010)03－0254－04

2009－11－2

湖南省研究生科研創(chuàng)新項目資助(No.2340－74236000001)。

成鋼(1976－)，男，講師，博士研究生，研究方向:東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關基因篩選。E－mail addresses:chenggang876@ 126.com

胡維新(1950－)，男，教授，博士生導師。E－mail addresses:weixinhu@yahoo.com.cn