劉伯雅,魏東芝,魯思然,周文瑜,沈亞領(lǐng)*,徐 韌,王金輝(.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 007；.國(guó)家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,上海 007；.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢4007)

靈菌紅素對(duì)有害藻類的除藻活性研究

劉伯雅1,魏東芝1,魯思然3,周文瑜1,沈亞領(lǐng)1*,徐 韌2,王金輝2(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237；2.國(guó)家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,上海 200137；3.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢430072)

研究了沙雷氏菌的天然產(chǎn)物靈菌紅素對(duì)引起海洋赤潮和淡水水華的有害藻類的除藻活性和光解性質(zhì).結(jié)果表明,5.0μg/mL靈菌紅素能夠在24h內(nèi)將新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻培養(yǎng)液中的藻類全部殺死,除藻活性高達(dá)100%.5.0μg/mL靈菌紅素在30000lx光強(qiáng)下36h完全分解,不會(huì)給自然環(huán)境帶來(lái)二次污染.

靈菌紅素；除藻；赤潮；水華；光解

Abstract：Prodigiosin (PG), a secondary metabolite (red pigment) produced by Serratia marcescens and other bacteria, possesses a lot of bioactivity. However, its algicidal effect was not researched in detail. The algicidal activity of prodigiosin against harmful algae, causing red tide and fresh water bloom, and its light decomposition were studied. The algicidal concentration of prodigiosin for completely killing harmful algae in 24 hours including Nitzschia closterium, Skeletonema costatum, Anabena flosaquae and Merismopedia spp. were 5.0 μg/mL. When 5.0 μg/mL prodigiosin was exposed under the light of 30000lx for 36 h, all prodigiosin was photodecomposed. The light sensistivity of prodigiosin will not bring secondary pollution to the natural environment.

Key words：prodigiosin；algicidal effect；red tide；water blooms；photodecomposition

由于海洋、湖泊、水庫(kù)等水體的富營(yíng)養(yǎng)化,各種藻類大量繁殖導(dǎo)致赤潮和水華的暴發(fā).黏土[1]、硫酸銅[2]、有機(jī)農(nóng)藥[3-4]、溶藻病毒[5]、溶藻細(xì)菌[6]、濾食性魚類[7]、水生植物[8]以及植物化感作用[9]等各種物理、化學(xué)、生物方法被應(yīng)用于赤潮和水華的治理.但物理、化學(xué)方法均不可避免地將造成環(huán)境二次污染.生物方法總體上尚處于初期研究階段,仍有不少問題需要解決.因此,開發(fā)一種見效快、用量少、對(duì)環(huán)境友好、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便的除藻劑成為解決赤潮和水華問題的迫切需要.

靈菌紅素(prodigiosin)是一類天然紅色素家族的總稱, 是由多種放線菌(Streptomyces)和細(xì)菌(Serratia, Pseudomonas)產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物[10-11].韓國(guó)科學(xué)家在海邊土壤里篩選到一株能生產(chǎn)靈菌紅素的海洋細(xì)菌,并將其命名為Hahella chejuensis KCTC2396,該細(xì)菌生產(chǎn)的抗生素具有強(qiáng)烈的細(xì)胞溶解酶活性,對(duì)海洋赤潮藻C.polykrikoides具有較好的除藻活性[12].日本科學(xué)家在海邊篩選到一株能生產(chǎn)靈菌紅素類似物PG-L-1的海洋細(xì)菌MS-02-063,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該靈菌紅素類似物對(duì)H.akashiwo、H.circularisquama、C.polykrikoides、Gyrodinium impudicum和Alexandrium tamarense具有一定的除藻活性[13].

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素,并對(duì)其進(jìn)行分離純化及鑒定,進(jìn)而研究靈菌紅素對(duì)新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻的除藻活性以及光解特性.

1 材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)為本實(shí)驗(yàn)室保藏.新月菱形藻(Nitzschia closterium)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)由中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)提供.水華魚腥藻(Anabena flos-aquae)和微小平列藻(Merismopedia spp.)由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供.

NLF 22 30L生物反應(yīng)器(瑞士比歐生物工程公司);752型紫外光柵分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);高效液相色譜儀(Agilent Technologies, Inc.); Agilent orbax SB-C18色譜柱; Micromass LCT TOF質(zhì)譜儀;水沖式真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司); SPX-300B-G光照培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);XB-K-25血球計(jì)數(shù)板(浙江省玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠); CoolPIX 4500顯微鏡(Nikon).

葡萄糖為工業(yè)級(jí),酵母粉和蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司,其余試劑均為分析純.

黏質(zhì)沙雷氏菌種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉1,蛋白胨2,甘油12.6,(NH4)2SO46, K2HPO410, NaCl 0.5, MgSO40.5.以NaOH調(diào)pH值至7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨30,葡萄糖5,K2HPO40.2, ZnSO40.5, MnSO40.04, NaCl 0.5.以NaOH調(diào)pH值至7.2.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)控制 通過(guò)流加氨水閉環(huán)控制pH在7.0,通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量及增大轉(zhuǎn)速來(lái)維持菌體生長(zhǎng)所需的氧氣,維持DO大于20%.

1.2.2海洋赤潮微藻的培養(yǎng) 新月菱形藻和中肋骨條藻采用改良的f/2培養(yǎng)液在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)箱內(nèi)溫度23℃,光強(qiáng)為3000lx,采用12h光暗循環(huán)培養(yǎng)模式.每天定時(shí)搖晃4～5次.

1.2.3淡水水華微藻的培養(yǎng) 水華魚腥藻和微小平列藻采用BG11培養(yǎng)液在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),其他條件同海洋赤潮微藻.

1.2.4靈菌紅素的分離純化 在黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵液中添加硫酸銨使其濃度為200g/L,充分?jǐn)噭蚝笾糜?℃冰箱內(nèi)隔夜存放,第2d7000r/min離心15min,收集菌體和蛋白沉淀物,按體積比1:10將離心沉淀物混勻于酸性甲醇溶液中進(jìn)行靈菌紅素萃取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去溶劑,濃縮液用乙酸乙酯溶解,低溫靜置,除去不溶物雜質(zhì),得到靈菌紅素的乙酸乙酯溶液,以氯仿與乙酸乙酯混合液(體積比2:1)為流動(dòng)相, 經(jīng)過(guò)第1次硅膠柱層析,靈菌紅素洗脫液濃縮去溶劑,再經(jīng)過(guò)第2次硅膠柱層析梯度洗脫,流動(dòng)相為正己烷與乙酸乙酯混合溶液(體積比 5:1),除去黃色素等雜質(zhì);再以正己烷與乙酸乙酯混合溶液(體積比 1:1)為流動(dòng)相洗脫靈菌紅素,洗脫液經(jīng)過(guò)蒸發(fā)濃縮得到靈菌紅素樣品.

將得到的樣品進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描、高效液相色譜分析和TOF-MS質(zhì)譜鑒定.

高效液相色譜檢測(cè)條件:儀器為高效液相色譜儀;流動(dòng)相為10%的50mmol/L三乙胺＋90%乙腈,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0;檢測(cè)波長(zhǎng)為535nm;色譜柱為Agilent orbax SB-C18(250 mm×4.6mm, 5μm);柱溫40℃;流速1mL/min;進(jìn)樣量10μL.

1.2.5靈菌紅素除藻實(shí)驗(yàn) 將分離純化得到的靈菌紅素樣品用極少量甲醇溶解,再用純水稀釋至不同的濃度梯度, 添加0.6mL靈菌紅素稀釋液至達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液29.4mL中,搖勻,各藻的初始藻細(xì)胞密度均為1.0×105個(gè)/mL.因?yàn)殪`菌紅素具有光解的特性,為了最大限度的發(fā)揮靈菌紅素的除藻作用效果,本實(shí)驗(yàn)將添加靈菌紅素的藻液首先置于培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)12h,然后繼續(xù)按照光暗循環(huán)模式培養(yǎng),定時(shí)取樣,顯微鏡下計(jì)數(shù),只計(jì)數(shù)沒有發(fā)生裂解的完整的藻細(xì)胞,確定靈菌紅素的除藻活性.將不添加靈菌紅素的藻液作為對(duì)照.

1.2.6靈菌紅素光解實(shí)驗(yàn) 將裝有5.0μg/mL靈菌紅素溶液的試管分別暴露于3000lx和30000lx燈光下, 觀察靈菌紅素水溶液的顏色變化,測(cè)定水溶液里靈菌紅素含量.

1.3分析方法

1.3.1藻細(xì)胞的計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察 將培養(yǎng)容器內(nèi)的藻液混勻,取一滴至血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)計(jì)數(shù).將血球計(jì)數(shù)板置于Nikon顯微鏡下觀察,放大倍數(shù)為400倍.除藻活性(%)＝[(初始培養(yǎng)液中活藻細(xì)胞密度－靈菌紅素作用后培養(yǎng)液中活藻細(xì)胞密度)/初始培養(yǎng)液中活藻細(xì)胞密度]×100

1.3.2靈菌紅素的測(cè)定 采用分光光度法測(cè)定靈菌紅素濃度.1mL發(fā)酵液加入9mL酸性甲醇(pH 3)中, 振蕩后離心,測(cè)上清的OD535值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線得靈菌紅素的濃度.標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=3.939X+ 0.0265(R2=0.9996),其中Y為靈菌紅素濃度;X為靈菌紅素溶液OD535測(cè)定值.光解率(%)=[(初始靈菌紅素濃度–殘留靈菌紅素濃度)/初始靈菌紅素濃度]×100.

2 結(jié)果

2.1靈菌紅素的分離及鑒定

將樣品經(jīng)過(guò)分離純化后進(jìn)行高效液相色譜分析,見圖1.與空白進(jìn)樣結(jié)果對(duì)比可知,6.2min, 535nm處的峰值為樣品溶質(zhì)峰.由此可判斷硅膠柱二次層析后的樣品純度較高,＞95%.

圖1 靈菌紅素HPLC分離圖譜Fig.1 The HPLC analysis of prodigiosin

最終分離得樣品通過(guò)紫外全波長(zhǎng)掃描儀(圖2),質(zhì)譜儀測(cè)定確為靈菌紅素.樣品在堿性和酸性條件下的最大吸收波長(zhǎng)分別為466nm和535nm.樣品的質(zhì)譜分析結(jié)果表明m/z=324(圖3),其分子量323恰好是靈菌紅素分子對(duì)應(yīng)的分子量,進(jìn)一步證實(shí)樣品為靈菌紅素.紫外全波長(zhǎng)掃描和質(zhì)譜分析結(jié)果與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道一致.

2.2靈菌紅素對(duì)新月菱形藻的除藻活性

圖2 堿性與酸性條件下的紫外全波長(zhǎng)掃描圖譜Fig.2 The scan map of alkaline and acidic prodigisoin in all-wavelengh

圖3 靈菌紅素的TOF MS圖譜Fig.3 The TOF MS analysis of prodigiosin

由圖4可見,添加5.0μg/mL靈菌紅素12h后,除藻活性接近80%,添加10.0μg/mL靈菌紅素12h后,除藻活性達(dá)到100%,藻類幾乎全部裂解死亡.將除藻活性達(dá)到100%的藻液重新接種到新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d,鏡檢觀察未發(fā)現(xiàn)形態(tài)完好的新月菱形藻細(xì)胞,由此可進(jìn)一步確證,裂解的藻細(xì)胞已經(jīng)死亡.

未添加靈菌紅素的新月菱形藻經(jīng)過(guò)3d的培養(yǎng), 藻細(xì)胞密度由初始的1.0×105個(gè)/mL增殖到5.35×105個(gè)/mL,藻液中未發(fā)現(xiàn)裂解的藻細(xì)胞.

圖4 靈菌紅素對(duì)新月菱形藻的除藻活性Fig.4 Algicidal effects of prodigiosin against Nitzschia closterium

2.3靈菌紅素對(duì)中肋骨條藻的除藻活性

圖5 靈菌紅素對(duì)中肋骨條藻的除藻活性Fig.5 Algicidal effects of prodigiosin against Skeletonema costatum

由圖5可見,添加7.0μg/mL靈菌紅素0.5h后,除藻活性接近100%,添加1.0μg/mL靈菌紅素18h后, 除藻活性達(dá)到100%,中肋骨條藻幾乎全部裂解死亡.將除藻活性達(dá)到100%的藻液重新接種到新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d,鏡檢觀察未發(fā)現(xiàn)形態(tài)完好的中肋骨條藻細(xì)胞.與圖4對(duì)比,低濃度靈菌紅素在短時(shí)間內(nèi)可將中肋骨條藻全部殺死,這表明中肋骨條藻對(duì)靈菌紅素的敏感性比新月菱形藻強(qiáng).

未添加靈菌紅素的中肋骨條藻經(jīng)過(guò)3d的培養(yǎng), 藻細(xì)胞密度由初始的1.0×105個(gè)/mL增殖到2.0×105個(gè)/mL,藻液中未發(fā)現(xiàn)形態(tài)遭到破壞的中肋骨條藻細(xì)胞.

受靈菌紅素作用前與作用后2h的中肋骨條藻藻細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察表明,正常的中肋骨條藻細(xì)胞透鏡形或圓柱形,殼面圓而鼓起,輪廓圓滑,而受靈菌紅素作用后的藻細(xì)胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞破裂,輪廓不清晰,形態(tài)上發(fā)生了很大變化.

2.4靈菌紅素對(duì)水華魚腥藻的除藻活性

由圖6可見,添加5.0μg/mL靈菌紅素6h后,除藻活性超過(guò)75%,24h后, 除藻活性可達(dá)100%.而添加1.5μg/mL靈菌紅素12h后,除藻活性也達(dá)到90%.將除藻活性達(dá)到100%的水華魚腥藻培養(yǎng)液重新接種到新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d,未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖.

未添加靈菌紅素的水華魚腥藻經(jīng)過(guò)3d的培養(yǎng),藻細(xì)胞密度由初始的1.0×105個(gè)/mL增殖到2.95×105個(gè)/mL.

圖6 靈菌紅素對(duì)水華魚腥藻的除藻活性Fig.6 Algicidal effects of prodigiosin against Anabena flos-aquae

2.5靈菌紅素對(duì)微小平列藻的除藻活性

由圖7可見,添加5.0μg/mL靈菌紅素24h后,除藻活性達(dá)到100%,添加1.5μg/mL靈菌紅素24h后,除藻活性接近80%.將除藻活性達(dá)到100%的微小平列藻培養(yǎng)液重新接種到新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d,未發(fā)現(xiàn)形態(tài)完好的藻細(xì)胞.

而未添加靈菌紅素的微小平列藻經(jīng)過(guò)3d的培養(yǎng), 藻細(xì)胞密度由初始的1.0×105個(gè)/mL增殖到2.74×105個(gè)/mL.

圖7 靈菌紅素對(duì)微小平列藻的除藻活性Fig.7 Algicidal effects of prodigiosin against Merismopedia spp.

受靈菌紅素作用前與作用后12h的微小平列藻藻細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察表明,正常的微小平列藻呈圓形或橢圓形,兩兩排在一起, 輪廓圓滑,呈深綠色;而受靈菌紅素作用后的藻細(xì)胞破裂,胞質(zhì)外泄, 輪廓不清晰,藻體顏色變淺, 細(xì)胞開始凋亡.

2.6靈菌紅素的光解性質(zhì)

靈菌紅素水溶液在光的照射下,紅色逐漸變淺,最終褪去.由圖8所示,在光強(qiáng)為30000lx的強(qiáng)光照射36h后,5.0μg/mL靈菌紅素幾乎完全分解,隨著照射光強(qiáng)度減小,靈菌紅素分解速率變慢,在光強(qiáng)為3000lx的燈光照射48h后,超過(guò)60%的靈菌紅素被光解.

圖8 靈菌紅素的光解率變化Fig.8 Photodecomposition of prodigiosin

2.7討論

本研究發(fā)現(xiàn),由陸生細(xì)菌黏質(zhì)沙雷氏菌所生產(chǎn)的次級(jí)代謝物靈菌紅素不僅對(duì)引起我國(guó)東海赤潮的有害藻類新月菱形藻和中肋骨條藻有很好的除藻效果,而且對(duì)引起淡水水華的有害藻類水華魚腥藻和微小平列藻也具有較好的除藻效果.其中靈菌紅素對(duì)引起淡水水華的藻類的除藻研究在國(guó)內(nèi)尚屬首次.由于靈菌紅素的光解特性,經(jīng)過(guò)靈菌紅素處理的藻液首先置于培養(yǎng)箱中在黑暗條件下培養(yǎng)12h,然后再進(jìn)行光暗循環(huán)模式培養(yǎng).5.0μg/mL靈菌紅素能夠在24h內(nèi)將新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻培養(yǎng)液中的藻類全部殺死,除藻活性高達(dá)100%.隨著靈菌紅素濃度的降低,其除藻活性也在降低.另外,從圖4、圖5、圖6和圖7中可以看到,靈菌紅素對(duì)各種藻類作用12h后,其除藻活性與時(shí)間的比值減小,在24h之后繼續(xù)減小,說(shuō)明靈菌紅素除藻活性隨時(shí)間延長(zhǎng)有所降低,這是由于經(jīng)過(guò)靈菌紅素處理的藻液在12h黑暗模式培養(yǎng)之后,進(jìn)入光照模式培養(yǎng),藻液中的靈菌紅素在12h之后逐步光解,濃度下降所致.而未添加靈菌紅素的藻液經(jīng)過(guò)3d培養(yǎng),藻細(xì)胞均大量增殖.

Landsberg[16]和Yamasaki等[17]分別發(fā)現(xiàn)了多環(huán)旋溝藻和米氏凱倫藻能夠分泌活性氧(ROS),可以推測(cè),大多數(shù)海洋藻類可能都能夠分泌活性氧.活性氧對(duì)于某些海洋藻類來(lái)說(shuō),可能是重要的生長(zhǎng)因子或有絲分裂刺激物[18].Kim等[19]認(rèn)為活性氧合成酶類似于NADPH氧化酶. NADPH氧化酶能夠被靈菌紅素類似物抑制[20].因此, 靈菌紅素也可能對(duì)NADPH氧化酶和ROS合成酶起到抑制作用, 進(jìn)而抑制藻細(xì)胞分泌活性氧,最終導(dǎo)致藻類細(xì)胞的裂解死亡.靈菌紅素除藻機(jī)理有待深入研究.

3 結(jié)論

3.1由黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然紅色素經(jīng)分離、純化,鑒定為靈菌紅素.

3.2靈菌紅素具有高效的除藻活性.5.0μg/mL靈菌紅素能夠在24h內(nèi)將新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻培養(yǎng)液中的藻類全部殺死,除藻活性高達(dá)100%.隨著靈菌紅素濃度的降低,其除藻活性也在降低.

3.3靈菌紅素具有光解特性.在光強(qiáng)為30000lx燈光照射下,5.0μg/mL靈菌紅素能夠在36h內(nèi)完全分解.而在光強(qiáng)為3000lx的燈光照射下,靈菌紅素在14h內(nèi)可分解大約50%.

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致謝：本論文的除藻活性研究工作由東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心徐韌主任、王金輝科長(zhǎng)以及其他科室成員等協(xié)助完成, 在此表示感謝.

Algicidal activity of prodigiosin against harmful algae

. LIU Bo-ya1, WEI Dong-zhi1, LU Si-ran3, ZHOU Wen-yu1, SHEN Ya-ling1*, XU Ren2, WANG Jin-hui2(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China；2.East China Sea Environmental Monitoring Center, State Oceanic Administration, Shanghai 200137, China；3.College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China). China Environmental Science, 2010,30(4)：477～482

X52

A

1000-6923(2010)04-0477-06

劉伯雅(1983-),男,河北任丘人,華東理工大學(xué)碩士研究生, 主要從事微生物學(xué)研究.

2009-08-19

國(guó)家“863”項(xiàng)目(2007AA092004);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(B505)

* 責(zé)任作者, 教授, ylshen@ecust.edu.cn