三種化感物質(zhì)對水華混合藻類以及多刺裸腹蚤的毒性作用

鄭春艷,張 哲,胡 威,許文武,汪好芬,張庭廷(安徽師范大學生命科學學院,生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室,安徽 蕪湖 241000)

三種化感物質(zhì)對水華混合藻類以及多刺裸腹蚤的毒性作用

鄭春艷,張 哲,胡 威,許文武,汪好芬,張庭廷*(安徽師范大學生命科學學院,生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室,安徽 蕪湖 241000)

為使脂肪酸和酚酸類化感物質(zhì)能安全有效地用于實際水體水華的預(yù)防和控制,以池塘水華混合藻類以及浮游動物多刺裸腹蚤為實驗對象,考察了亞油酸、水楊酸和對羥基苯甲酸對兩者的毒性作用.結(jié)果表明,亞油酸對池塘水華混合藻類具有極高毒,當0.3mg/L時,對水華混合藻類的最大抑制率達到87.6%,水楊酸與對羥基苯甲酸為中毒;化感物質(zhì)兩兩聯(lián)合作用時均具有協(xié)同抑藻效應(yīng),亞油酸與水楊酸聯(lián)合協(xié)同抑制作用最強;3種化感物質(zhì)也從不同程度上顯示出對多刺裸腹蚤的毒性作用,但亞油酸對多刺裸腹蚤屬于高毒,水楊酸以及對羥基水楊酸屬于低毒,3者對多刺裸腹蚤的EC50均明顯大于對池塘水華混合藻類的EC50,表明了利用這3種化感物質(zhì)(尤其是亞油酸)來開發(fā)生物除藻劑的巨大潛能,同時也說明在可除藻的濃度范圍內(nèi)對環(huán)境的不良影響可能較小.

化感物質(zhì)；水華混合藻類；多刺裸腹蚤；毒性

Abstract：To safely and effectively apply fatty acids and phenolic acids to control and prevent water-bloom, the article studied the toxicity of linoleic acid, salicylic acid and p-hydroxybenzoic acid on natural algal assemblage of pond water and zooplankton Moina macrocopa. The results showed that linoleic acid had the strongest toxicity, while salicylic acid and p-hydroxybenzoic acid had moderate toxicity on the natural algal assemblage of pond water, when the concentration of linoleic acid was 0.3mg/L, the biggest inhibitory ratio was up to 87.6%. The collective activity of a mixture of two allelochemicals were also examined and the synergistic growth inhibition on the natural algal assemblage were proved, in which the mixture of linoleic acid and salicylic acid had stronger toxicity. The three allelochemicals to some extent also showed toxicity on Moina macrocopa, but linoleic acid had stronger toxicity, while salicylic acid and p-hydroxybenzoic acid had lower toxicity on Moina macrocopa, the EC50sof the three allelochemicals on Moina macrocopa was far higher than the EC50son the natural algal assemblage, which indicated that there exists great potential for using the three allelochemicals, especially linoleic acid, to be developed biological algicide agent while no evident toxicity on environment within the concentrations of controling the growth of water-bloom algae.

Key words：allelochemicals；natural algal assemblage；Moina macrocopa；toxicity

藍藻水華不僅導(dǎo)致生物多樣性減少,水體景觀價值和服務(wù)功能降低,而且藍藻的次生代謝產(chǎn)物微囊藻毒素(MC)能損害肝臟,促進肝癌發(fā)生,

直接威脅人類的健康和生存[1].化感物質(zhì)的研究為水華的治理提供了較好的思路[2].迄今為止發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)幾乎都是植物次生代謝物.按照化感物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)可將其分為5大類:脂肪族、芳香族、含氧雜環(huán)化合物、類萜和含氮化合物[3-4].而脂肪酸和酚酸是其中兩類重要的化感物質(zhì)[5-6].有研究表明[7-8]亞油酸、亞麻酸等多種多不飽和脂肪酸對海洋藻類有不同程度的抑制作用;本課題組從大型水生植物普生輪藻(Chara vulgaris)中分離得到亞油酸、軟脂酸和豆蔻酸三種脂肪酸類化感物質(zhì),發(fā)現(xiàn)亞油酸具有很強的抑藻作用[9].酚酸類化感物質(zhì)對藻類抑制作用的報道也很多[10-12],如從高等水生植物穗花狐尾藻中分離出多種對銅綠微囊藻具有很強抑制作用的多酚[12].

迄今為止,關(guān)于化感物質(zhì)抑藻效應(yīng)的研究大多是以單一化感物質(zhì)作用于單一藻類,或者是兩種化感物質(zhì)作用于一種藻類等,對天然水體中的混合藻類尤其是水華爆發(fā)后的混合藻類的抑制作用報道較少.為探討脂肪酸和酚酸類化感物質(zhì)對實際水體混合藻類的抑制作用,本研究在實驗室條件下以富營養(yǎng)化的天然池塘水體混合藻類為實驗材料,考察了脂肪酸(以亞油酸為代表)和酚酸類化感物質(zhì)(以水楊酸和對羥基苯甲酸為代表)的抑藻效果;同時,為探討這3種化感物質(zhì)能否安全有效地應(yīng)用于天然水體水華的預(yù)防和控制,研究了這3種化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤(Moina macrocopa)的毒性作用.

1 材料與方法

1.1實驗材料

多刺裸腹蚤(Moina macrocopa)由本校生命科學院席貽龍教授實驗室提供;亞麻酸為東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品(Tokyo chemical industry Co.LTD);亞油酸為Sigma公司(St. Louis, MO, USA)產(chǎn)品;對羥基苯甲酸、水楊酸購于北京化學試劑公司;所有試劑均為分析純.

1.2抑藻實驗

1.2.1樣本采集及處理 考慮到藍藻在水體的垂直分布,于2007年7月18日中午在安徽師范大學校園已爆發(fā)水華的富營養(yǎng)化池塘約水下1cm處取樣,用100目的塑料紗網(wǎng)過濾以除去群體藻及小型水生動物[13-14],濾液(過濾后的含藻水樣,下稱藻液)經(jīng)本院周守標教授鑒定發(fā)現(xiàn)其主要優(yōu)勢種為藍藻門(Cyanophyta)的微囊藻屬和綠藻門(Ch lorophyta)的小球藻(Chlorella).在藻液中添加適量BG-11培養(yǎng)基后馴化培養(yǎng)48h再進行抑藻實驗.

1.2.2單一化感物質(zhì)對池塘混合藻類的抑制作用 在已洗凈消毒的500mL三角錐形瓶中加入300mL經(jīng)馴化后的藻液,參照本課題組對單一藻抑制實驗的結(jié)果[10,15]分別加入不同劑量的脂肪酸類化感物質(zhì)(亞油酸)或酚酸類化感物質(zhì)(水楊酸、對羥基苯甲酸)(具體數(shù)據(jù)見后),振搖,置光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng).培養(yǎng)條件:光照度4000Lx,光周期12h:12h,溫度(24±2).℃每天搖動錐形瓶4次.實驗期間每天取藻液測定藻細胞葉綠素a含量[11,13],連續(xù)5d.

1.2.3兩種化感物質(zhì)聯(lián)合對池塘混合藻類的抑制作用 實驗方法同1.2.2,并參照1.2.2實驗結(jié)果所得出的EC50添加亞油酸與水楊酸以及水楊酸與對羥基苯甲酸聯(lián)合抑藻.

1.3脂肪酸和酚酸類化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤的毒性作用

1.3.1多刺裸腹蚤培養(yǎng) 多刺裸腹蚤繁殖培養(yǎng)以及毒性實驗方法均參照國家標準方法[16-17],具體為采用500mL的燒杯,先在燒杯內(nèi)裝入一定量經(jīng)24h曝氣除氯的自來水,再加進多刺裸腹蚤,密度約每100mL培養(yǎng)液5～10個,每2～3d更換1次培養(yǎng)液,每天喂養(yǎng)1次斜生柵藻濃縮懸浮藻液,斜生柵藻的密度約104～105個左右,藻液的顏色為淡蘋果綠色.實驗前把懷卵量多的雌蚤用玻璃吸管吸出,用100mL小燒杯分開單個喂養(yǎng),待產(chǎn)幼蚤達二代后將健康幼蚤挑出作為實驗蚤.

1.3.2預(yù)實驗 正式實驗前,為確定實驗濃度范圍,首先分別對各種化感物質(zhì)進行預(yù)實驗,以確定測試化感物質(zhì)的毒性范圍.每組實驗中,每只燒杯以10只蚤為一組,亞油酸濃度為0.1,0.4,1.6,6.4, 12.8mg/L;水楊酸濃度為13,69,124,179,234mg/L;對羥基苯甲酸濃度為82,220,359,497,635mg/L.每濃度3個平行,同時設(shè)對照組.觀察24h后,求出100%抑制濃度(絕對抑制濃度EC100)和無抑制濃度(最大耐受濃度EC0),然后根據(jù)預(yù)備實驗得出的濃度范圍來確定正式實驗所用的濃度[18-19].

1.3.3單一化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤的毒性實驗 根據(jù)預(yù)實驗在EC100～EC0濃度范圍內(nèi)選取6個不同濃度,亞油酸濃度為0.2,0.4,0.8,1.6,3.2, 6.4mg/L;水楊酸濃度為55,83,110,138,166, 193mg/L;對羥基苯甲酸濃度為110,193,276,359, 442,525mg/L;設(shè)不加化感物質(zhì)的空白對照組,每組3個平行.從培養(yǎng)容器挑選個體健壯,大小差不多的第2代幼蚤進行實驗.在100mL的燒杯中隨機放10只多刺裸腹蚤,置光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng).培養(yǎng)條件同預(yù)試驗,實驗期間不喂食,于24,48, 72h定時觀察多刺裸腹蚤活動受限制(游動抑制)的蚤數(shù).

1.4數(shù)據(jù)處理

整個抑藻實驗所得數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0軟件處理, 通過單因素方差分析檢驗有關(guān)化感物質(zhì)對池塘水華混合藻類的影響、通過概率法求出各化感物質(zhì)的EC50;藻生長抑制率(IR)根據(jù)公式:IR(%)=(1–N/N0)×100進行計算,其中,N為實驗組葉綠素a含量(mg/L), N0為同期對照.毒性試驗通過查表[20]將多刺裸腹蚤的抑制率換算成概率,用濃度-概率法通過Excel建立回歸方程,求出EC50,再按文獻[20]計算EC50的95%置信限.

2 結(jié)果與分析

2.1單一化感物質(zhì)對池塘水華的影響

由圖1可見,3種化感物質(zhì)均具有很強的抑制池塘水華混合藻類的作用,以亞油酸的抑制作用最強,實驗第1,2,3,4d,EC50分別為0.57,0.26, 0.09,0.07mg/L,而第5d只有0.06mg/L,最大抑制率出現(xiàn)在0.3mg/L亞油酸組,與同期對照相比,最大抑制率為87.6%,P＜0.05;兩酚酸組對池塘水華藻類的抑制作用總體較亞油酸弱,同時顯示出了其多面性:低濃度水楊酸(40mg/L)組對池塘水華藻類有輕度的促進作用,雖然統(tǒng)計學處理顯示無明顯差異,但促進趨勢明顯;實驗第1,2,3,4,5d,水楊酸及對羥基苯甲酸抑藻作用的EC50分別為109.57,86.24,71.38,52.31,42.76mg/L,131.85,115.23, 76.16,78.57,82.62mg/L.水楊酸及對羥基苯甲酸最大的生長抑制率分別在第5d,第3d,達到了81.2%,和61.9%.統(tǒng)計學顯示,兩酚酸對池塘水華藻類的生長抑制均具有顯著性(P＜0.05).根據(jù)國家環(huán)境保護總局《新化學物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》(HJ/T 154—2004)中的分級標準[21],亞油酸屬于極高毒(24h或48h EC50(mg/L)＜1),水楊酸以及對羥基水楊酸屬于中毒(24h或48h EC50(mg/L)＞10～100).因此,該結(jié)果進一步提示利用這3種化感物質(zhì)尤其是對水華混合藻類極高毒的亞油酸來進行生物殺藻劑的研究開發(fā)是具有巨大潛能的.

圖1 三種不同化感物質(zhì)單獨對池塘水華混合藻類的抑制作用Fig.1 Effects of three different allelochemicals on water bloom algae of pond water, respectively

2.2化感物質(zhì)聯(lián)合對池塘水華的影響

根據(jù)上述實驗結(jié)果,聯(lián)合實驗設(shè)計為:① 0.2mg/L亞油酸+70.0mg/L水楊酸;②0.2mg/L亞油酸+70.0mg/L對羥基苯甲酸;③70.0mg/L水楊酸+70.0mg/L對羥基苯甲酸,根據(jù)文獻[12]方法計算在實驗的第5d組合①的抑制率應(yīng)為71.4%～ 86.6%,組合②的抑制率應(yīng)為68.9%～77.2%,組合3的抑制率為53.8%～65.9%,但由圖2可知,組合①和組合②在第4d已將池塘混合藻類全部殺死,抑制率達100%,組合③抑藻率也達到了89.5%,具有顯著性差異(P＜0.05),表明3種組合均具有十分明顯的協(xié)同抑藻作用.但相比之下,亞油酸參與的組合抑藻效果更佳,這可能與化感物質(zhì)組合后的作用機制不同有關(guān),因此后期研究中需要對此進行深入探討.

2.33種化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤的毒性作用

圖2 化感物質(zhì)聯(lián)合對池塘水華混合藻類的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects on natural algal assemblage ofpond water by mixture of allelochemicals

3種化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤的毒性作用見表1.由表1中實驗數(shù)據(jù)求出各時間內(nèi)濃度與概率單位的回歸方程以及EC50的95%置信限(表2).

由表2可知,3種化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤也具有不同程度的毒性作用,根據(jù)國家環(huán)境保護總局《新化學物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》(HJ / T 154—2004) 中的分級標準[21],亞油酸對于多刺裸腹蚤屬于高毒(24h或48h EC50＞1～10mg/L),水楊酸以及對羥基水楊酸屬于低毒(24h或48h EC50＞100 mg/L). 但比較亞油酸對于多刺裸腹蚤以及池塘水華混合藻類的作用則不難看出,亞油酸對多刺裸腹蚤的EC50無論在24h、48h還是72h都遠遠比亞油酸對池塘水華混合藻類的EC50大得多,是抑藻時的4～9倍之多,這無疑提示了在利用亞油酸來預(yù)防或治理水華的濃度范圍內(nèi),對環(huán)境中多刺裸腹蚤的安全性威脅不會很大.同樣,水楊酸和對羥基苯甲酸對多刺裸腹蚤的EC50也較其抑制池塘水華混合藻類的EC50高,特別是對羥基苯甲酸,這些也同樣提示了若利用這兩種酚酸類物質(zhì)來預(yù)防和治理水華藻類對環(huán)境的安全性影響可能較小.

表1 3種化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤毒性實驗結(jié)果Table 1 The toxicity experiment results of the three allelochemicals to Moina macrocopa

表2 3種化感物質(zhì)對多刺裸腹蚤的EC50(mg/L)及95%置信限Table 2 EC50(mg/L) and 95% confidence limits of the three allelochemicals to Moina macrocopa

3 討論

化感作用定義為“一種植物通過向環(huán)境中釋放化學物質(zhì)影響其他生物生長的現(xiàn)象”.釋放的化學物質(zhì)稱為化感物質(zhì)[3].利用化感物質(zhì)抑制水華藻類的生長是目前環(huán)境領(lǐng)域研究的一大熱點.本研究中的亞油酸、水楊酸以及對羥基苯甲酸均發(fā)現(xiàn)可由某些水生和陸生植物分泌,并對其他植物產(chǎn)生化感作用[6,8-12].雖然植物向環(huán)境中釋放的化感物質(zhì)不一定能夠達到有效的濃度,但通過對化感物質(zhì)的研究可為開發(fā)生物除藻劑等提供有價值的參考依據(jù).

對酚酸和脂肪酸的抑藻作用的有關(guān)研究大多是采用單一化感物質(zhì)抑制單一藻類, 對復(fù)合藻類的抑制作用研究相對較少.另外,不同的化感物質(zhì)對藻類的毒性大小不一,對環(huán)境中的其他生物的毒性也不一樣,對水華藻類抑制作用大的可能對環(huán)境中的其他生物毒性較小;反過來,對水華藻類抑制作用小的也可能對環(huán)境中的其他生物毒性作用較大.如張庭廷等[22]研究了17種脂肪酸類物質(zhì)的抑藻作用,揭示了脂肪酸的抑藻活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān),即不飽和脂肪酸的抑藻效果較飽和脂肪酸好,不飽和程度越高抑制作用越佳,飽和脂肪酸中碳鏈越短抑藻效果越好.而 Liu 等[23]采用了亞油酸等9種偶數(shù)碳脂肪酸去抗4種植物病原體,發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸的抗生效果較好,碳鏈越長抗生作用越強,而兩種不飽和脂肪酸抑制作用最差,這與脂肪酸類物質(zhì)抑藻效應(yīng)所得結(jié)果剛好相反.因此,若采用化感物質(zhì)開發(fā)生物除藻劑時,必須考察化感物質(zhì)對環(huán)境的其他生物的可能毒性,這樣才不至于造成新的生態(tài)平衡失調(diào).

4 結(jié)論

4.1亞油酸、水楊酸以及對羥基苯甲酸對池塘水華混合藻類均具有顯著的抑制作用,其中亞油酸的作用最強,按照對藻類生長抑制毒性分級標準,亞油酸屬于極高毒,水楊酸與對羥基苯甲酸屬于中毒;3種化感物質(zhì)兩兩聯(lián)合作用時具有協(xié)同抑藻效應(yīng),亞油酸與水楊酸聯(lián)合協(xié)同抑制作用最強.

4.23種化感物質(zhì)也顯示出對多刺裸腹蚤的毒性作用,但按照蚤類急性活動抑制毒性分級標準,亞油酸對多刺裸腹蚤屬于高毒,水楊酸以及對羥基水楊酸屬于低毒.

4.33種化感物質(zhì)對池塘水華混合藻類的EC50明顯小于對多刺裸腹蚤的EC50,表明了利用這3種化感物質(zhì)(尤其是亞油酸)來開發(fā)生物殺藻劑的巨大潛能,同時也說明在可殺藻的濃度范圍內(nèi)對環(huán)境的不良影響可能較小.

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The toxic effect of three allelochemicals on natural algal assemblage and Moina macrocopa.

ZHENG Chun-yan, ZHANG Zhe, HU Wei, XU Wen-wu, WANG Hao-fen, ZHANG Ting-ting*(The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China). China Environmental Science, 2010,30(5)：710～715

X171.5

A

1000-6923(2010)05-0710-06

鄭春艷(1982-),女,安徽淮北人,安徽師范大學生命科學學院碩士研究生,主要研究方向為淡水藻類生態(tài)學.發(fā)表論文3篇.

2009-09-30

國家自然科學基金資助項目(30870429);安徽師范大學博士科研啟動基金

* 責任作者, 教授, cyhztt@mail.ahnu.edu.cn