張平 張志培 李香敏 雷杰 蘇凱 李小飛 王小平

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，因此急需對(duì)這一疾病進(jìn)行深入的研究。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，磷酸酶家族中的肝再生磷酸酶（phosphatase of regenerating liver, PRL）亞家族包括PRL1-3三種分子，其成員PRL-3高表達(dá)在結(jié)直腸癌[1,2]、卵巢癌[3]和胃癌[4]等腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用，但有關(guān)PRL-3在肺癌中的作用機(jī)制仍不十分清楚；RhoC屬于小分子G蛋白超家族中的Rho亞家族，是Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要分子，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，調(diào)控各種細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)建成等功能[5]，并可通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)加快細(xì)胞遷移[6,7]。許多研究[8-10]表明RhoC在多種腫瘤中高表達(dá)并與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，但是在該通路中RhoC蛋白活化及其信號(hào)傳遞機(jī)制尚不清楚。Fiordalisi等[11]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)提示PRL-3可能是通過(guò)激活Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤的運(yùn)動(dòng)與轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用抗體分別阻斷A549細(xì)胞中PRL-3和RhoC的功能，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩者對(duì)其遷移能力的影響，并應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)PRL-3和RhoC表達(dá)的變化，為進(jìn)一步研究它們?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 A549細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科實(shí)驗(yàn)室提供，鼠抗人PRL-3單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，兔抗人RhoC多克隆抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，新生牛血清為蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品，RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均為TaKaRa產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在96孔板背面用Marker通過(guò)孔的直徑畫(huà)標(biāo)記線，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接種于96孔板，每孔約8 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿后吸出培養(yǎng)液，用200 μL Tip頭垂直于標(biāo)記線劃痕，PBS液沖洗3次；第1排加入含1:400抗人PRL-3抗體的5%血清培養(yǎng)液，第2排加入含1:400抗人RhoC抗體的5%血清培養(yǎng)液，第3排加入不含抗體的5%血清培養(yǎng)液作對(duì)照。分別于0 h、6 h、12 h、24 h照相。

1.3 RT-PCR 將細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中所用的三組A549細(xì)胞分別接種至培養(yǎng)瓶中，每組8瓶，共24瓶，繼續(xù)應(yīng)用含1:400抗人PRL-3抗體、含1:400抗人RhoC抗體以及不含抗體的5%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿85%后用RNAiso Plus提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR檢測(cè)三組細(xì)胞中PRL-3和RhoC的表達(dá)情況。反應(yīng)條件：β-actin：95oC、5 min；94oC、30 s，54oC、40 s，72oC、1 min，35個(gè)循環(huán)；72oC、5 min；4oC保存產(chǎn)物。PRL-3：95oC、5 min；94oC、30 s，61oC、40 s，72oC、1 min，35個(gè)循環(huán)；72oC、5 min；4oC保存產(chǎn)物。RhoC：95oC、5 min；94oC、30 s，57oC、40 s，72oC、1 min，35個(gè)循環(huán)；72oC、5 min；4oC保存產(chǎn)物。所用引物序列、目的片段長(zhǎng)度、退火溫度見(jiàn)表1。應(yīng)用AlphaImager系統(tǒng)中的SpotDenso分析工具測(cè)定RT-PCR各個(gè)目標(biāo)條帶的光密度值（isodensity value, IDV）值。

表 1 β-actin、PRL-3、RhoC基因引物序列Tab 1 Primer sequences of β-actin, PRL-3 and RhoC genes

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，使用Paired Samples t Test分析RT-PCR結(jié)果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 0 h時(shí)觀察：三組細(xì)胞劃痕良好，劃痕寬度基本一致；6 h時(shí)觀察：對(duì)照組細(xì)胞向劃痕處爬行明顯，加PRL-3抗體、RhoC抗體的兩組細(xì)胞遷移不明顯；12 h時(shí)觀察：對(duì)照組細(xì)胞已爬行至劃痕中心，加PRL-3抗體、RhoC抗體的兩組細(xì)胞劃痕寬度較0 h明顯變窄，兩組之間無(wú)明顯差別；24 h時(shí)觀察：對(duì)照組細(xì)胞已基本爬滿劃痕，加PRL-3抗體、RhoC抗體的兩組細(xì)胞仍未爬行至劃痕中心，兩組之間無(wú)明顯差別。培養(yǎng)液中加抗體的細(xì)胞的遷移速度明顯比培養(yǎng)液中不加抗體的細(xì)胞慢，加PRL-3抗體、RhoC抗體的兩組細(xì)胞遷移速度無(wú)明顯差別（圖1，圖中粗線為Marker標(biāo)記）。

2.2 RT-PCR結(jié)果 加RhoC抗體組PRL-3表達(dá)的IDV值為（21 509 514.75±1 100 223.540），對(duì)照組PRL-3表達(dá)的IDV值為（21 826 848.25±877 815.062），兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.047, P=0.08）；加PRL-3抗體組RhoC表達(dá)的IDV值為（38 303 080.13±1 907 724.847），對(duì)照組RhoC的表達(dá)的IDV值為（56 822 463.00±2 690 278.654），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.032, P＜0.001）（圖2）。PRL-3的表達(dá)在加RhoC抗體組與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.08），RhoC的表達(dá)在加PRL-3抗體組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

3 討論

人類PRL-3基因位于染色體8q24.3，編碼173個(gè)氨基酸，其分子質(zhì)量約為20 kDa，屬于非典型磷酸酪氨酸蛋白磷酸脂酶，核磁共振分析表明PRL-3以單體形式存在，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由5個(gè)β折疊和6個(gè)α螺旋組成，它們的排列和整體折疊方式為雙特異性磷酸酶（dual-specificity phosphatase, DSP）所特有。具有催化活性的Cys104、Arg110和它們之間的幾個(gè)疏水性氨基酸組成的P-環(huán)構(gòu)成了PRL-3的磷酸酶活性中心，后者可能決定著PRL-3底物的特異性，使得PRL-3有別于其它雙特異磷酸酶。72位的Asp則起到一個(gè)廣義酸的作用，其所在的嚕噗環(huán)結(jié)構(gòu)獨(dú)立于蛋白的其它結(jié)構(gòu)域，在PRL-3和底物結(jié)合時(shí)可以發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)于PRL-3磷酸酶活性的發(fā)揮具有重要作用[12,13]，主要在心肌、平滑肌和骨骼肌等正常組織中表達(dá)[14]。Saha等[1]發(fā)現(xiàn)PRL-3在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移組織中過(guò)度表達(dá)，在正常結(jié)、直腸粘膜和原位癌中低度表達(dá)，在伴轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌中中度表達(dá)，而且在隨訪中還發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌切除術(shù)后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率隨原發(fā)癌組織中PRL-3表達(dá)強(qiáng)度的增高而增加，這一發(fā)現(xiàn)提示PRL-3可能有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的功能。Fiordalisi等[15]應(yīng)用異戊二烯轉(zhuǎn)移酶抑制劑FTI-2153處理轉(zhuǎn)染了PRL-3的SW480細(xì)胞后，PRL-3由胞漿的膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并且喪失了促進(jìn)細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的能力。Dursina等[16]成功篩選得到了兩個(gè)化合物，對(duì)PRL-3等蛋白的異戊二烯化修飾具有較強(qiáng)的抑制作用，這些研究為更深入研究PRL-3的功能奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比分析阻斷PRL-3功能前后A549細(xì)胞遷移能力的變化，發(fā)現(xiàn)阻斷PRL-3功能后A549細(xì)胞的遷移能力明顯減慢，這一現(xiàn)象再次提示PRL-3可能有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的功能。

圖 1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)Fig 1 Wound healing assays

圖 2 β-actin、PRL-3、RhoC基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳成像Fig 2 Gel electrophoresis photographs of RTPCR products amplified for β-actin, PRL-3 and RhoC gene

RhoC基因定位于1p13-p21，其編碼蛋白含193個(gè)氨基酸，屬于Ras超家族中的小GTP結(jié)合蛋白亞家族，在真核細(xì)胞中作為分子開(kāi)關(guān)控制著眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[17]。RhoC蛋白具有調(diào)控細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)建成等功能[5]，并可通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)促進(jìn)細(xì)胞遷移[6,7]。在該通路中，RhoC蛋白的活化及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用抗體阻斷RhoC功能，研究A549細(xì)胞遷移能力的變化，發(fā)現(xiàn)阻斷RhoC功能后A549細(xì)胞的遷移能力明顯減慢，再次證實(shí)RhoC可能有加快細(xì)胞遷移的功能。

在前期研究中，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了92例人非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中PRL-3和RhoC的表達(dá)具有相關(guān)性，提示兩者可能存在相互作用；同時(shí)在轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的人非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中PRL-3和RhoC蛋白的表達(dá)均較高，兩者可能具有促進(jìn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能[18]。在這一發(fā)現(xiàn)的提示下我們做了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗體阻斷PRL-3和RhoC功能后，A549細(xì)胞遷移能力降低，這一現(xiàn)象提示PRL-3和RhoC可能有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的功能，這一現(xiàn)象再次證實(shí)了上述結(jié)論。我們應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)阻斷兩者后A549細(xì)胞中RhoC和PRL-3表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中加PRL-3抗體的A549細(xì)胞中RhoC的表達(dá)降低，提示PRL-3可能通過(guò)某些環(huán)節(jié)上調(diào)RhoC的表達(dá)，PRL-3可能通過(guò)RhoC及其下游因子促進(jìn)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前RhoC蛋白比較明確的功能是引起F-肌動(dòng)蛋白的重組和動(dòng)態(tài)變化[19]，但是在該通路中RhoC蛋白活化及其信號(hào)傳遞機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PRL-3可能是該通路中RhoC蛋白的上游信號(hào)分子，通過(guò)上調(diào)RhoC蛋白的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；但PRL-3的活化及其信號(hào)傳遞機(jī)制并不十分清楚，有關(guān)PRL-3信號(hào)通路上游分子的研究可能會(huì)給腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究打開(kāi)一個(gè)新的視野。在本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)加RhoC抗體的A549細(xì)胞中PRL-3的表達(dá)無(wú)明顯改變，提示RhoC對(duì)PRL-3的表達(dá)可能無(wú)反饋性調(diào)節(jié)作用，PRL-3和RhoC所在信號(hào)通路的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)功能可能通過(guò)其它分子執(zhí)行，這方面的研究還需進(jìn)一步深入。