李紅梅 滑峰 趙誠(chéng) 劉光振 周清華

肺癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均位于所有惡性腫瘤首位，危害極大。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高肺癌生存期的關(guān)鍵。大量研究[1]表明，端粒酶的活化是大部分腫瘤發(fā)生的前提條件，端粒酶活性表達(dá)存在于肺癌發(fā)生的早期階段，端粒酶的異?；罨c肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。以往文獻(xiàn)[2]報(bào)道的肺癌端粒酶活性檢測(cè)標(biāo)本多來源于手術(shù)切除標(biāo)本、纖支鏡活檢標(biāo)本或肺泡灌洗液等，這些方法均存在一定的局限性，有研究表明肺癌患者痰或惡性胸腔積液中端粒酶的活性高度表達(dá)，在肺癌的早期診斷中具有重要作用。本文采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（TせP-PCR-ELISA）的方法分別測(cè)定了肺癌伴胸水患者和良性病變伴胸水患者的誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性，探討端粒酶聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2007年1月-2008年12月確診的80例肺癌伴胸水患者，其中男性50例，女性30例，年齡49歲-76歲，平均年齡59.5歲；鱗癌39例，腺癌21例，小細(xì)胞癌15例，大細(xì)胞癌5例。肺部良性病變患者50例，均伴有胸水，其中男性32例，女性18例，年齡47歲-73歲，平均齡57.5歲；其中結(jié)核性胸膜炎25例，肺炎18例，支氣管擴(kuò)張5例，肺膿腫2例。肺癌組患者經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)并且未做過治療。肺部良性病變組選用呼吸系統(tǒng)常見疾病并排除其它部位的腫瘤的患者。

1.2 誘導(dǎo)痰標(biāo)本的采集與處理 肺癌患者及良性病變組均收集誘導(dǎo)痰。誘導(dǎo)方法[3]為：常規(guī)吸入沙丁胺醇200 μg，然后超聲霧化吸入流量為1 mL/min的3%-5%的高滲鹽溶液20 min，整個(gè)過程鼓勵(lì)患者咳嗽，收集痰液3 mL-5 mL于無菌杯中，立即用4oC無菌生理鹽水洗滌兩遍，加入等量的1 moL/L NaOH堿液，置4oC冰箱24 h堿化，取溶解痰液于4oC、3 000 r/min，離心10 min，棄上清液。沉淀重懸于PBS中，4oC、3 000 r/min，再次離心10 min，棄上清液，沉淀置于-80oC冰箱中待用。檢測(cè)時(shí)取出冷凍的標(biāo)本在冰上解凍后重懸于200 μL的端粒酶裂解液中冰浴、離心后移取上清液至EP管中待用。

1.3 胸水細(xì)胞提取液的制備 常規(guī)行胸腔穿刺術(shù)抽取新鮮胸水100 mL送檢，離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清，離心細(xì)胞置液氮中保存（-196oC）。檢測(cè)前用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）漂洗細(xì)胞2次，分別離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清。加預(yù)冷的端粒酶裂解緩沖液，0oC 孵化30 min，離心（4oC, 12 000 r/min, 20 min），吸出上清液（含端粒酶），取少許測(cè)定蛋白濃度，將細(xì)胞提取物稀釋至3 μg/μL。

1.4 纖維支氣管鏡活組織檢查 采用Olympus CV 2260型電子纖維支氣管鏡對(duì)所有患者進(jìn)行檢查，采取活檢的肺組織，用PBS液沖洗后用液氮速凍置于-80oC冰箱保存。檢測(cè)時(shí)取冰凍活檢組織，剪碎，加入100 μL細(xì)胞裂解液充分混勻，水浴30 min，4oC、1 600 r/min離心20 min，收集上清液置于-80oC冰箱凍存?zhèn)溆?。在操作纖支鏡前常規(guī)進(jìn)行心電圖、胸片或胸部CT檢查、血常規(guī)及出、凝血時(shí)間檢查。纖維支氣管鏡未能證實(shí)的肺癌患者均通過經(jīng)皮肺穿或開胸活檢、痰中或胸水中檢測(cè)脫落細(xì)胞最終得以證實(shí)。

1.5 端粒酶活性測(cè)定 采用TRAP-ELISA法，將上述各種標(biāo)本的沉淀細(xì)胞（約1×105-1×106）置于1.5 mL離心管，150 μL裂解液抽提端粒酶。端粒酶活性和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)：5×端粒重復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)混合液10 μL，TaqDNA多聚酶（5 U/μL）0.4 μL，樣品提取液2 μL，蒸餾水37.6 μL。采用PCR擴(kuò)增儀，酶反應(yīng)：30oC，30 min。PCR循環(huán)擴(kuò)增：94oC，30 s；55oC，30 s，35個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照加2 μL裂解液；陽(yáng)性對(duì)照加1 μL端粒酶質(zhì)控模板溶液。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)包被好的微量96孔板捕獲后，加人辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗二硝基苯抗體（Anti-DNP）孵育1 h后洗滌，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色10 min。MK3酶標(biāo)儀（Dragon Lab System公司）上用雙波長(zhǎng)法測(cè)定各孔波長(zhǎng)450 nm吸光度（A450）、波長(zhǎng)690 nm吸光度（A690）的值，A690為參考，用于消除孔間誤差。端粒酶活性為△A= A450-A690?！鰽大于陰性對(duì)照孔的2.0倍即判定為端粒酶陽(yáng)性。敏感性=肺癌組測(cè)定指標(biāo)的陽(yáng)性例數(shù)/肺癌組總例數(shù)；特異性=良性疾病組測(cè)定指標(biāo)的陰性例數(shù)/良性疾病組的總例數(shù)；準(zhǔn)確性=（真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù)）/研究總例數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包，端粒酶活性定量值以Mean±SD表示，比較采用t檢驗(yàn)；不同病理類型的肺癌伴胸水患者間誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶活性的比較采用方差分析；端粒酶活性陽(yáng)性率比較用兩樣本率的χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

80例肺癌患者通過纖維支氣管鏡檢查確診為肺癌的有60例，胸水中檢出腫瘤細(xì)胞的12例，經(jīng)皮肺穿活檢或淋巴結(jié)活檢的有8例。肺癌伴胸水患者和肺部良性病變伴胸水患者在誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶活性的定量比較見表1，結(jié)果顯示肺癌伴胸水患者三種標(biāo)本中端粒酶的活性均明顯高于肺部良性病變患者（P＜0.001）。

不同病理類型的肺癌患者三種標(biāo)本中端粒酶活性的比較見表2（經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)四組不同病理類型的肺癌患者的總體方差相同），其三種標(biāo)本的端粒酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

三種標(biāo)本中端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷敏感性、特異性和準(zhǔn)確性見表3，其中三種標(biāo)本聯(lián)合檢測(cè)敏感性的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：三種標(biāo)本有一個(gè)以上檢測(cè)為陽(yáng)性即判斷為陽(yáng)性，三種標(biāo)本全為陰性即判斷為陰性。聯(lián)合檢測(cè)的敏感性與單獨(dú)檢測(cè)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

端粒是真核生物染色體末端包含著獨(dú)特重復(fù)片段的特殊結(jié)構(gòu)，在保護(hù)染色體和染色體復(fù)制方面起著重要作用。線性染色體末端的DNA合成是不完全的，隨著每次細(xì)胞分裂，端粒片段會(huì)進(jìn)行性縮短，最終會(huì)導(dǎo)致衰老細(xì)胞的凋亡或程序性死亡。端粒長(zhǎng)度被認(rèn)為是細(xì)胞的“有絲分裂鐘”，而端粒酶作為一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠以自身RNA為模板，合成端粒末端重復(fù)（TTAGGG）n，對(duì)穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度從而使細(xì)胞獲得無限增殖能力和不致死性，成為永生細(xì)胞，甚至惡性轉(zhuǎn)變，發(fā)揮重要作用[4]。端粒酶是迄今為止發(fā)現(xiàn)的較為廣譜的腫瘤標(biāo)志物[5]，已成為最有希望的抗腫瘤的靶點(diǎn)之一[6]。端粒酶在肺癌組織中選擇性的高表達(dá)，為以端粒酶為靶點(diǎn)進(jìn)行肺癌的基因治療提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)[7]。90%以上癌細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性，雖然其端粒長(zhǎng)度很短，但由于端粒酶的激活維持了端粒長(zhǎng)度，因而有可能獲得無限增殖，而端粒酶活性增高不存在于正常組織和體細(xì)胞[8]。

Sen等[9]分別檢測(cè)了42例可疑肺癌患者及10例良性肺病變患者的痰液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）和活檢（氣管鏡）標(biāo)本的端粒酶活性，結(jié)果表明，42例可疑肺癌患者中痰液、BAL、活檢標(biāo)本端粒酶陽(yáng)性率分別為81.6%、68.4%、86.8%，10例良性肺病變者僅1例BAL陽(yáng)性低表達(dá)，隨后被證實(shí)有大量的炎性細(xì)胞。評(píng)價(jià)分析表明端粒酶鑒別良、惡性肺癌的敏感性和特異性，在痰標(biāo)本分別為81.6%、100%，在BAL標(biāo)本為68.4%、100%，而活檢標(biāo)本為86.8%、100%。近年來，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者[10-12]通過對(duì)肺癌患者痰脫落細(xì)胞、纖維支氣管鏡刷檢物及胸水脫落細(xì)胞端粒酶活性的檢測(cè)，證明端粒酶在上述組織中高表達(dá)，說明端粒酶在肺癌的生成和發(fā)展方面具有重要作用。端粒酶活性的表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[13,14]，隨著腫瘤分化程度由高到低，端粒酶陽(yáng)性率呈升高趨勢(shì)。

表 1 肺癌伴胸水和肺部良性病變伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性（Mean±SD）Tab 1 The expression of telomerase activity in induced sputum, pleural effusion and fiberobronchoscopic biopsy in lung cancer patients and benign pulmonary disease patients with pleural effusion (Mean±SD)

表 2 不同病理類型肺癌伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性（Mean±SD）Tab 2 The expression of telomerase activity in induced sputum, pleural effusion and fiberobronchoscopic biopsy in lung cancer patients with different pathological types (Mean±SD)

表 3 誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶活性的診斷價(jià)值Tab 3 The diagnotic value of telomerase activity in induced sputum, pleural effusion and fiberobronchoscopic biopsy

本研究對(duì)80例肺癌伴胸水患者和50例肺部良性病變伴胸水患者，分別檢測(cè)其誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活檢組織中端粒酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶的活性分別為0.488±0.163、0.376±0.123和0.463±0.144；肺部良性病變伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶的活性分別為0.091±0.110、0.075±0.009和0.088±0.108，肺癌組均明顯高于肺部良性病變組。鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌的患者間三種標(biāo)本的端粒酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明端粒酶活性檢測(cè)可作為肺癌篩選的標(biāo)志物。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶活性的陽(yáng)性率分別為62.5%（50/80）、46.3%（37/80）和60.0%（48/80），亦即誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性對(duì)肺癌的診斷敏感性分別為62.5%、46.3%和60.0%。準(zhǔn)確性分別為66.2%、53.8%和63.8%，誘導(dǎo)痰檢測(cè)敏感性與纖維支氣管鏡活組織檢測(cè)敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，胸水檢測(cè)敏感性較前兩者低。三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性分別為85.0%和82.3%，其中敏感性與單獨(dú)的誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織的敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

有文獻(xiàn)[15]報(bào)道誘導(dǎo)痰中端粒酶活性的檢測(cè)有助于肺部良惡性疾病的診斷和鑒別診斷。診斷敏感性約為80%；胸水中端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)肺癌診斷的敏感性約為45%。有研究表明在纖維支氣管鏡活組織中，端粒酶活性在肺癌患者明顯高于肺炎患者和正常人。本研究聯(lián)合檢測(cè)誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性，對(duì)肺癌的診斷敏感性較單項(xiàng)檢測(cè)大大提高，由于痰、胸水和纖支鏡活檢組織標(biāo)本容易獲得，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌伴胸水患者的早期診斷有重要意義，但因樣本量較少，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。