魏克強,趙婷,王建軍,宋欣

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.太原鐵路局 太原供電段,山西太原 030013;3.河北保定師范?？茖W(xué)校涿州分校,河北涿州072750)

在自然條件下,由于食物分布在時空上的不均勻性、季節(jié)更替或環(huán)境劇變等原因,即使在飼養(yǎng)條件下,由于食物供給不足,動物在其生命周期中經(jīng)常會面臨食物資源的短缺而遭受饑餓脅迫。當(dāng)脅迫條件改善或消失,一些動物呈現(xiàn)出補償生長(compensatory growth)的現(xiàn)象。研究表明,饑餓脅迫對魚類的生存發(fā)育、生化組成、繁殖習(xí)性和消化系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)均有顯著的影響[1～8],Bisbal和Bengtson等認為:研究饑餓狀態(tài)下消化系統(tǒng)的組織學(xué)變化,對評價魚類的營養(yǎng)狀況具有重要的意義[8]。迄今,有關(guān)蝦類饑餓與補償生長方面的研究還比較少,僅發(fā)現(xiàn)饑餓脅迫對斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、鋸額長臂蝦(Palaemon serratus)的消化腺組織結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生顯著的影響[9～10],克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)、中國對蝦(Penaeus chinensis)、南美白對蝦(Penaeus vannamei)和日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)[11～14]等少數(shù)蝦類具有補償生長效應(yīng)。

克氏原螯蝦Procambarus clarkii(Girard)隸屬甲殼綱(Crustacea),十足目(Decapoda),螯蝦科(Cambaridae),是一種適應(yīng)性強、分布廣、生長快、繁殖率高、食性雜的淡水蝦類,不僅是淡水漁業(yè)資源的重要組成部分,而且還被用作環(huán)境科學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、藥理學(xué)研究的模式動物[15]。在克氏原螯蝦的消化系統(tǒng)中,胃起碎化與過濾食物的作用,中腸負責(zé)消化與吸收。肝胰腺是重要的消化腺,上皮細胞可分為分泌細胞(B細胞)、吸收細胞(R細胞)、纖維細胞(F細胞)和胚胎細胞(E細胞)4種,其中,R細胞中有與物質(zhì)的合成與儲存功能相適應(yīng)的結(jié)構(gòu),如脂肪滴、液泡等,F細胞有發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),胞質(zhì)中含大量的分泌顆粒,主要功能是合成各種消化酶,B細胞中有大液泡、豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體,主要是起分泌作用[16,17]。

本文以克氏原螯蝦的胃、中腸和肝胰腺為研究對象,研究其在饑餓脅迫下組織結(jié)構(gòu)的變化,旨在為蝦類的營養(yǎng)研究以及養(yǎng)殖實踐提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

克氏原螯蝦購自太原市某農(nóng)貿(mào)市場,健康活潑、體形正常,體長約3 cm,體重為(4.65±0.17)g。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)條件

實驗開始前一周暫養(yǎng)于玻璃水族箱(100 cm×50 cm×55 cm,實際水量40 L)內(nèi)進行馴養(yǎng),每箱10尾,每日定時充足投喂人工配合微顆粒飼料5次,殘餌于下次投喂前收集,糞便及時用吸管取出。水族箱為循環(huán)水系統(tǒng),并配以充氣泵連續(xù)充氣,水溫控制在(25.0±1.0)℃范圍(室溫由空調(diào)調(diào)節(jié))。

1.2.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)計參考文獻[1,11]的方法。實驗分為饑餓組和對照組,每組30尾,每箱10尾。對照組按1.2.1的方法充足投食,實驗組饑餓20 d。為防止饑餓時螯蝦相互殘殺,饑餓組在實驗階段用帶孔(直徑為0.5 cm)的半透明塑料板將水族箱分隔成10室,每室放1尾蝦,饑餓結(jié)束時拆除塑料隔板。

1.2.3 樣品處理

在實驗結(jié)束時,從各箱分別隨機取4尾蝦的胃、中腸和肝胰腺,部分樣品Davidson's AFA液固定24 h,70%酒精沖洗并保存,常規(guī)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,厚度 5～6μm,在 Leica Qwin圖像分析儀上觀察并拍照。另一部分樣品迅速切成1 mm3小塊,2.5%冷戊二醛和1%鋨酸雙重固定,0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)漂洗三次,每次約15 min,系列乙醇梯度脫水。掃描電鏡材料脫水后移入醋酸異戊酯置換,臨界點干燥,渡膜,于XL30ESEM掃描電鏡觀察并拍照。透射電鏡樣品脫水后環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,以醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,在JEM-1200EX型透射電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

胃、中腸和肝胰腺是克氏原螯蝦的主要消化器官,對照組的觀察結(jié)果顯示,螯蝦的胃上皮為單層柱狀上皮,上皮下為疏松結(jié)締組織,胃上皮下無任何腺體(圖版Ⅰ,圖1～3);中腸腸壁自內(nèi)向外分為幾丁質(zhì)層、上皮層、結(jié)締組織層、肌層和外膜層,腸壁向腸腔內(nèi)突出形成縱褶,每條縱褶的上皮又形成許多小的皺褶,皺褶上有密集的微絨毛(圖版Ⅰ,圖4、圖5;圖版Ⅱ,圖1);肝胰腺肝盲管管壁由肝細胞和分泌細胞構(gòu)成,肝細胞長形,內(nèi)含食物泡或呈空泡狀,分泌細胞梭形,夾雜于肝細胞之間(圖版Ⅰ,圖 6 、圖 7;圖版Ⅱ ,圖 2)。

饑餓20 d后,實驗螯蝦均存活,胃、中腸和肝胰腺的一般組織學(xué)結(jié)構(gòu)未遭到嚴重破壞。觀察結(jié)果顯示:與對照組比較,饑餓組螯蝦的胃壁變薄,結(jié)締組織膜間間隙增大,呈疏松狀(圖版Ⅰ,圖8);中腸管腔變窄,腸壁變薄,呈透明狀,單層柱狀上皮細胞分界模糊,皺褶變得少而淺,微絨毛減少(圖版Ⅰ ,圖9、圖 10;圖版 Ⅱ,圖 3);肝胰腺萎縮,呈褐色,肝細胞內(nèi)脂滴減少,細胞間隙增大(圖版Ⅰ,圖11、圖12),肝盲管分泌物減少(圖版Ⅱ,圖4);饑餓螯蝦的胃上皮細胞(圖版Ⅱ,圖 5、圖 6)、腸上皮細胞(圖版Ⅱ,圖 7)尤其是肝細胞(圖版 Ⅱ,圖8、圖9)中有一部分線粒體的嵴開始消失,呈模糊狀且排列不整齊;一部分線粒體開始空泡化,基質(zhì)的電子密度降低;一部分線粒體內(nèi)室腫脹,嵴大部分消失;部分肝胰腺細胞萎縮,細胞核變形(圖版Ⅱ,圖10),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、糖原顆粒減少(圖版Ⅱ,圖11、圖12),R細胞中豐富的脂肪滴大量減少(圖版Ⅱ ,圖13～15)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),饑餓脅迫下仔、稚魚的組織結(jié)構(gòu)主要呈現(xiàn)腸道組織粘膜層上皮細胞高度顯著下降,刷狀緣萎縮甚至消失,微絨毛斷裂,線粒體腫脹、嵴斷裂等特征[1～4,7,8,18]。研究還表明,蝦類對饑餓反應(yīng)最為敏感的是R細胞,R細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)可以作為評判甲殼動物餌料營養(yǎng)價值的檢測指標[9,10,19];饑餓狀態(tài)可導(dǎo)致斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)幼蝦消化腺細胞萎縮,微絨毛變短,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少,線粒體膨大;還使鋸額長臂蝦(Palaemon serratus)肝胰腺R細胞和F細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的嵴變短,線粒體膨大、數(shù)量減少。本實驗與上述研究結(jié)果相一致,饑餓脅迫對克氏原螯蝦肝胰腺組織R細胞的影響最為顯著,其次是中腸組織和胃組織的上皮細胞。

4 結(jié)論

通過組織學(xué)觀察的方法研究了饑餓脅迫對克氏原螯蝦消化器官組織結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):螯蝦胃壁變薄,中腸管腔變窄,肝胰腺萎縮,分泌物減少;中腸腸壁皺褶變得少而淺,微絨毛減少;肝細胞中脂肪滴大量減少,細胞間隙增大;胃、腸上皮細胞尤其是肝細胞內(nèi)線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡化,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、糖原顆粒減少。這說明在饑餓脅迫下,螯蝦消化器官的組織學(xué)結(jié)構(gòu)與功能都會明顯衰退。

圖版ⅠPlateⅠ圖1.對照組賁門胃橫切(x 50);圖2.對照組幽門胃縱切(x 50);圖3.對照組胃結(jié)締組織(x100);圖4.對照組中腸縱切(x 50);圖5.對照組中腸皺壁(x 200);圖6.對照組肝胰腺橫切(x100);圖7.對照組肝胰腺細胞(x200);圖8.饑餓組胃結(jié)締組織(x100);圖9.饑餓組中腸縱切(x 50);圖10.饑餓組中腸皺壁(x 200);圖11.饑餓組肝胰腺橫切(x100);圖12.饑餓組肝胰腺細胞(x200).圖中:CT結(jié)締組織;MF皺壁;HC肝細胞Fig.1 Transverse section of the cardiac stomach in control group.x 50;Fig.2 Longitudinal section of thephloric stomach in control group.x 50;Fig.3 Connective tissue of the stomach in control group.x 100;Fig.4 Longitudinal section of the midgut in control group.x 50;Fig.5 M ucous folds of midgut in control group.x 200;Fig.6 Transverse section of hepatopancreas in control group.x 100;Fig.7 Hepatopancrentic cell of control crayfish.x 200;Fig.8 Connective tissue of the stomach in starvation group.x 100;Fig.9 Longitudinal section of the midgut in starvation group.x 50;Fig.10 Mucous folds of midgut in starvation group.x 200;Fig.11 Transverse section of hepatopancreasin starvation group.x 100;Fig.12 Hepatopancrentic cell of starveling crayfish.x 200.In figures:CT:Connective tissue.MF:Mucous folds.HC:Hepatopancrentic cell.

圖版ⅡPlateⅡ圖1.對照組中腸掃描電鏡圖,示皺壁明顯,微絨毛密集(x 3000);圖2.對照組肝盲管掃描電鏡圖,示分泌物豐富(x 5000);圖3.饑餓組中腸掃描電鏡圖,示皺壁變淺,微絨毛減少(x 3000);圖4.饑餓組肝盲管掃描電鏡圖,示分泌物減少(x 1000);圖5.對照組胃幾丁層下上皮細胞線粒體(x 15k);圖6.饑餓組胃幾丁層下上皮細胞部分線粒體腫脹,嵴大部分消失(箭頭所示,x 15k);圖7.饑餓組中腸上皮細胞嵴斷裂(箭頭所示,x 20k);圖8.饑餓組肝胰腺R細胞線粒體嵴大部分消失(箭頭所示,x 15k);圖9.饑餓組肝胰腺表面微絨毛下細胞線粒體空泡化(箭頭所示,x 15k);圖10.饑餓組肝胰腺細胞萎縮、核變形(x 4000);圖11.對照組肝胰腺F細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍豐富的糖原顆粒(x 20k);圖12.饑餓組肝F細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、糖原顆粒消失(箭頭所示,x 15k);圖13.對照組肝胰腺R細胞脂滴豐富(x 5000);圖14.對照組 R細胞脂滴周圍豐富的線粒體(x 6000);圖15.饑餓組肝胰腺R細胞脂滴消失(x 15k)圖中:Mv微絨毛;Se分泌物;CL幾丁質(zhì);Ld脂滴。圖5～圖15,比例尺:500nm.Fig.1 Showing mucous folds and dense microvilliin midgut lumen of control crayfish,observed by SEM.x 3000;Fig.2 Showing abundant secretion on the tubular type gland surface of control crayfish,observed by SEM.x 5000;Fig.3 Showing mucous folds decreased in size and number and microvilli sparse in midgut lumen after 20 d starvation,observed by SEM.x 3000;Fig.4 Showing decreased secretion on the tubular type gland surface after 20 d starvation,observed by SEM.x 1000;Fig.5 Showing abundant mitochond rion in stomach epithelium under chitin layer in control cray fish.x15k;Fig.6 Showing ruptured cristaes of mitochondrion in stomach epithelium under chitin layer after 20 d starvation(arrow).x15k;Fig.7 Showing ruptured cristaes of mitochondrion in midgut epithelium after 20 d starvation(ar row).x20k;Fig.8 Showing ruptured and disappeared cristaes of mitochondrion in R cell after 20 d starvation(arrow).x15k;Fig.9 Showing the mitochondria vacuolated and the ridge of mitochondria ruptured in the cell of the hepatopancrentic epithelium(arrows).x15k;Fig.10 Showing hepatic cell shrank in size and nucleus deformed after 20 d starvation.x 4000;Fig.11 Showing abundant glucogen particals surrounding the rough endoplastic reticulum in F cell of control hepatopancreas.x20k;Fig.12 Showing disappeared glucogen particals and swollen rough endoplastic reticulum in F cell after 30d starvation(arrow).x15k;Fig.13 Showing abundant lipid d roplets in R cell of the normal hepatopancreas.x5000;Fig.14 Showing abundant mitochondrion surrounding lipid droplets in R cell of the normal hepatopancreas.x6000;Fig.15 Showing disappeared lipid d roplets in R cell after 20 d starvation.x15k.In figures:Mv:Microvilli;Se:Secretion;CL:Chitin layer;Ld:Lipid droplet.Fig.5～Fig.15,scale:500nm.

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