冀華,潘登奎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院,山西太谷,030801)

電泳法是本科生生物化學(xué)實驗中一門重要技術(shù),我國現(xiàn)常用的方法是醋酸纖維薄膜電泳[1,2]。醋酸纖維薄膜電泳分離及分析人血清蛋白作為一項基本方法,從20世紀(jì)70年代末到今天,依然是本科生生物化學(xué)實驗教學(xué)中重要的教學(xué)內(nèi)容之一[3,4]。該法操作簡便,效果直觀,本應(yīng)通過人血清蛋白電泳圖譜分析讓學(xué)生盡快掌握蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)基本原理。然而,受傳統(tǒng)點樣器點樣量可控性差及點樣位置等因素影響,使得易變因素較多,學(xué)生操作不易,尤其缺乏重復(fù)性[5]。因此,本科生一般在3個學(xué)時的實驗時間內(nèi),在一張膜上、一次點樣操作下,很難取得理想的電泳效果。這樣不僅大大影響了實驗教學(xué)技能訓(xùn)練效果,影響學(xué)生對技術(shù)方法的可信度,而且會影響學(xué)生對電泳實驗技術(shù)原理的深刻理解。隨著教育質(zhì)量工程建設(shè)工作的不斷深入,實驗教學(xué)改革愈來愈受到國際國內(nèi)高校的重視[6]。因此根據(jù)多年來的實驗管理和實驗教學(xué)工作經(jīng)驗,本實驗室就醋酸纖維薄膜電泳分離人血清蛋白技術(shù)中存在主要的問題,對點樣器進(jìn)行了改進(jìn)性研究,結(jié)合GIS-2009成像分析儀分析技術(shù),取得了一定的綜合性教學(xué)效果,希望能得到國內(nèi)同行的認(rèn)可和采納。

1 材料與方法

1.1 材料

人血清(太谷縣人民醫(yī)院檢驗科提供);醋酸纖維薄膜(型號:2 cm×8 cm,浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠提供)。

1.2 實驗試劑

染色液[0.5%的甲醇∶冰醋酸∶蒸餾水(去離子水)=50∶10∶40(V/V)為溶劑配置0.5%的氨基黑],脫色液[甲醇∶冰醋酸∶蒸餾水(去離子水)=45∶5∶50(V/V)],巴比妥鈉電極緩沖液(pH 8.6)。

1.3 實驗儀器

電泳儀[DYY-III-8B型,由北京六一儀器廠提供],水平電泳槽[DYCZ-28A型,北京六一儀器廠提供],凝膠圖像處理系統(tǒng) 2009[GIS-2009,為上海天能科技有限公司提供],毛細(xì)管[內(nèi)徑0.5 mm,長5 cm],毛細(xì)管尖端酒精噴燈加熱后用尖嘴鉗輕輕加壓,使圓形出口變?yōu)闄E圓形即可(詳見示意圖1a);自制點樣器為浙江武義文教針廠產(chǎn)的120型訂書針改制,該訂書針原端面原寬度為1.3 cm寬,用尖嘴鉗將端面折成4 mm,并適當(dāng)拋光,作為人血清點樣端面(見示意圖1b)。再將其尾部加熱后直接插入到事先準(zhǔn)備好的20 mm×10 mm×1 mm有機(jī)玻璃片合適位置,作為手持把柄以便于操作。點樣端用尖嘴鉗折成0.5 cm寬,并適當(dāng)打磨拋光作為人血清點樣品端面。

圖1 改制點樣器示意圖Fig.1 Diagram of improved sample appliance

1.4 試驗方法

點樣量的控制方法:事先用10μL微量注射器,分別取人血清5μL三次,注射到稱量紙上,在萬分之一分析天平上稱量重量之后求得其比重。然后用自制點樣器取樣后于天平上稱重,可求得相應(yīng)點樣量的體積。

電泳電壓為95 V,電泳時間40 min。

2 試驗結(jié)果

2.1 點樣器對人血清蛋白質(zhì)分離效果的影響

用直徑0.5 mm毛細(xì)管、120型訂書針端面和傳統(tǒng)的載玻片端面進(jìn)行點樣,醋酸纖維薄膜電泳結(jié)果見圖2,圖3和圖4。

圖2 毛細(xì)管點樣電泳結(jié)果Fig.2 Result of capillary electrophoresis

圖3 同一張膜上毛細(xì)管改性點樣器點樣結(jié)果Fig.3 Result of improved capillary sample appliance in the same membrane

圖4 載薄片與改制點樣器點樣電泳結(jié)果Table 4 Result of slides and improved capillary sample appliance

其中圖2為在同一張醋酸纖維薄膜上不同點樣量電泳結(jié)果,圖3為同一張醋酸纖維薄膜上點樣3μL樣的重復(fù)。從圖2,圖3和圖4電泳分帶清晰度看,圖4泳道3蛋白質(zhì)條帶清晰度和分離效果最佳,圖2泳道3以及圖3的泳道1和2效果次之,圖4的泳道1、2較差。即因點樣器引起的電泳效果優(yōu)劣順序為:改制的訂書針端面→毛細(xì)管點樣→載玻片端面。采用毛細(xì)管點樣時,就點樣量多少對電泳結(jié)果的影響角度來看,點樣1μL時α1-球蛋白顯得相當(dāng)微弱(圖 2泳道1),而 3μL最優(yōu)(圖2泳道3),點樣2μL次之(圖2泳道2)。從圖 3結(jié)果看,改性的毛細(xì)管在同一張醋酸纖維薄膜上,經(jīng)細(xì)心點樣后,重復(fù)性比較理想。而且除了明顯可以看到醋酸纖維薄膜電泳應(yīng)該看到的血清清蛋白、α1-球蛋白 、α2-球蛋白、β-球蛋白和 γ-球蛋白五條帶之外,在β-球蛋白和γ-球蛋白帶之間還能看到一條γ-球蛋白條帶。

用傳統(tǒng)的載玻片端面點樣(圖4泳道1,泳道2)和采用改制的訂書針端面點樣電泳結(jié)果(圖4泳道3,泳道4)對比分析,就分帶效果來看,采用改制的訂書針端面點樣效果明顯優(yōu)于載玻片端面點樣效果。其一,改制訂書針端面點樣電泳結(jié)果中,各種蛋白質(zhì)條帶無明顯拖尾和擴(kuò)散現(xiàn)象;其二,條帶比較均勻整齊,并且無明顯的邊緣效應(yīng)。從點樣量對電泳結(jié)果的影響角度來看,采用改制的訂書針端面點樣,改制的訂書針端面點樣量控制在3μL時,效果比5μL較好,但總體效果都優(yōu)于載玻片端面點樣的電泳效果(圖4)。

2.2 圖像分析儀對人血清蛋白質(zhì)分離效果的分析對比

用GIS-2009(凝膠圖像處理系統(tǒng))對圖2和圖4進(jìn)行分析,可進(jìn)一步看出不同點樣器點樣電泳結(jié)果優(yōu)劣差異。當(dāng)泳道寬度設(shè)置為10,條帶閾值為5,背景類型為“白”,谷峰連結(jié)為 30,扣除基線情況下,其圖2的掃描結(jié)果見圖5。

圖 5 電泳圖2的GIS掃描曲線Fig.5 GISscan curve of Fig.2

當(dāng)泳道寬度設(shè)置為20,條帶閾值設(shè)置為5,背景類型為“白”,谷峰連結(jié)為30,扣除基線情況下,其圖4掃描結(jié)果見圖6。

圖5和圖6中的縱坐標(biāo)為相應(yīng)泳道蛋白質(zhì)條帶的相對強(qiáng)度,它與蛋白質(zhì)條帶的顏色深淺、寬窄有關(guān)。即條帶越窄、顏色越深,峰頂(Int)越高,曲線下同樣面積情況下峰就越銳。當(dāng)相鄰峰之間的谷越靠近橫坐標(biāo),表明蛋白質(zhì)的等電點和分子量相近的蛋白質(zhì)分離的效果越好。

從圖6可以明顯看出,其中掃描曲線(c)圖中,峰 1、峰 2、峰 3、峰 4 和峰 5,不僅峰高 、且銳 ,同時峰與峰之間分隔明顯,而且峰、谷較深。說明采用毛細(xì)管點樣3μL人血清于醋酸纖維薄膜上,95V電壓40 min電泳分帶較好。

從圖4的泳道2和泳道3蛋白條帶的整體效果來看,泳道3,即采用改制的訂書針端面點樣效果要優(yōu)于載玻片端面的點樣點用效果。但由于采用GIS-2009(凝膠圖像處理系統(tǒng))分析過程中,限制了條帶的橫向?qū)挾葹?20(即總條帶寬度的20%),同時通過泳道移動功能將分析渠道調(diào)節(jié)在最佳范圍之內(nèi)。因此,從圖6的(a)、(b)、(c)和(d)比較可以看出,曲線(c)較曲線(b)峰、谷分隔更明顯可辨,間隔距離以及峰、谷深度較為明顯。

3 討論

生物化學(xué)實驗教學(xué)的目的與其他課程一樣,主要是用來提高學(xué)生的動手能力、培養(yǎng)學(xué)生觀察分析問題和解決問題的能力。此外,通過實驗教學(xué)過程幫助學(xué)生了解相關(guān)儀器及操作技能、技術(shù)和實驗基本原理,進(jìn)而為培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力提供基礎(chǔ)[7,8]。因此,醋酸纖維薄膜為載體分離人血清蛋白的電泳實驗,作為現(xiàn)代生物科學(xué)及生物化學(xué)十大技術(shù)之一的入門課程就顯得十分重要[9,10]。醋酸纖維薄膜電泳分離人血清蛋白質(zhì)的實驗教學(xué)內(nèi)容,融技術(shù)性、重復(fù)性、對比性和最終的實驗結(jié)果可視性為一體,對于本科生能力的培養(yǎng)不失為很好的教學(xué)內(nèi)容之一。

然而,由于采用傳統(tǒng)的載玻片(2.5 cm×5 cm)端面在醋酸纖維薄膜(2 cm×8 cm)上點樣,主要缺點有兩方面,其一,假如第一次點樣操作有誤,很難在同一張膜上重復(fù),即使要求學(xué)生在薄膜的另一端可再次點樣,明顯會影響電泳結(jié)果;其二,載玻片端面的寬度超過醋酸纖維薄膜的寬度,血清樣品會橫跨薄膜,蛋白質(zhì)條帶的邊緣效應(yīng)十分明顯(如圖4泳道1和2);其三,學(xué)生很難一次點樣操作達(dá)到理想的控制用量,直接影響蛋白質(zhì)分離效果。

采用改制的毛細(xì)管和改制的訂書針端面點樣,優(yōu)點有三。其一,無論采用改制的毛細(xì)管或改制的訂書針端面在同一張醋酸纖維薄膜(2 cm×8 cm)上進(jìn)行點樣,至少可以重復(fù)3次(見圖2和圖3),增加學(xué)生的試驗訓(xùn)練次數(shù)。其二,點樣量的可控性遠(yuǎn)比載玻片端面容易得多。因此,其三,電泳后得分帶效果比載玻片端面點樣(圖4泳道1和泳道2)后的血清中的清蛋白 、α1-球蛋白 、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白條帶更清晰,且各條帶拖尾現(xiàn)象降低,分離效果更好。

讓學(xué)生采用GIS-2009對人血清蛋白質(zhì)電泳結(jié)果采集后,在一定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求下,如泳道寬度設(shè)置為10,條帶閾值為5,背景類型為“白”,谷峰連結(jié)為30,扣除基線的情況下進(jìn)行簡單分析,會很快得出如圖5和圖6的分析結(jié)果。設(shè)計這樣的一步操作,對學(xué)生來說,既增加了一種操作技能訓(xùn)練,也會增加學(xué)生對現(xiàn)代技術(shù)手段的感性認(rèn)識。

圖 6 電泳圖3的GIS掃描曲線Fig.6 GIS scan curve of Fig 3.

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