喬兆揚(yáng)，曹 慧，徐 斐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

豆?jié){中皂甙的提取及測(cè)定

喬兆揚(yáng)，曹 慧*，徐 斐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

大豆皂甙具有眾多對(duì)人體有益的生理功能和生物活性，決定了它具有廣泛的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。采用乙醇、正丁醇提取豆?jié){中皂甙，并通過香草醛法測(cè)定其含量，探討了提取溫度、提取時(shí)間、豆?jié){與乙醇的配比及水飽和正丁醇的用量對(duì)豆?jié){中皂甙含量的影響。確定豆?jié){中大豆皂甙最優(yōu)提取工藝條件:反應(yīng)時(shí)間為3h，豆?jié){與乙醇配比為1∶5，水飽和正丁醇為90mL，反應(yīng)溫度為75℃，此條件下，每100mL豆?jié){中皂甙含量為89.668mg。

大豆皂甙，比色法，提取

Abstract:Soyasaponin has wide development and applicative prospect due to its beneficial physiological functions and biological activities for people.The saponins in soybean milk can be extracted using ethanol and butanol and detected by vanillin.The effects of the temperatures，times，the ratio of soybean milk to alcohol and the saturation of normal butanol on extraction were investigated.The results suggested that the optimum extraction conditions were temperature for 75℃，the time for 3h，the mass ratio of soybean milk to alcohol for 1∶5 and the volume for butanol at 90mL.In this condition，the concentration for soyasaponins was 89.668mg per 100mL soybean milk.

Key words:soyasaponin;colorimetric determination;extraction

豆?jié){是大豆經(jīng)過研磨后與水混合而成的乳白色飲品，因其營養(yǎng)豐富，口感好，越來越受到人們的青睞。豆?jié){中除了含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)及多種人體所需的微量元素，還富含不飽和脂肪酸、大豆皂甙、異黃酮等幾十種對(duì)人體有益的物質(zhì)，在降低人體膽固醇，防止高血壓，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗腫瘤等方面［1－3］具有很好的功效。其中大豆皂甙是一種具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的天然生物活性物質(zhì)，已經(jīng)普遍應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等行業(yè)中［4］。豆?jié){中的皂甙屬于三萜類齊墩果酸型化合物，是三萜類同系物的羥基和糖分子環(huán)狀半縮醛上的羥基失水縮合而成［5］。豆?jié){中皂甙含量的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于豆?jié){的加工工藝具有重要的指導(dǎo)意義，目前測(cè)定皂甙的方法主要有比色法、高效液相色譜法等。比色法因其方便快捷而被廣為應(yīng)用，但對(duì)其前處理?xiàng)l件即豆?jié){中皂甙的提取一直缺乏系統(tǒng)完整的研究，在一定程度上制約了其應(yīng)用，故采用比色法來測(cè)定豆?jié){中皂甙的含量并對(duì)其提取條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇(75%)、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯 上海高信化波儀器有限公司，分析純;乙醚、正丁醇、無水甲醇、香蘭素 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

DX－SZ4電熱恒溫水浴鍋 上海華連醫(yī)療器械有限公司;N－1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 EYELA;SHZ－88臺(tái)式水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;722S分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑配制方法

1.2.1.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取齊墩果酸10mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制得濃度為0.2μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，備用。

1.2.1.2 水飽和的正丁醇與正丁醇飽和的水的配制

取60mL正丁醇和40mL水充分混合，靜止分層，上層為水飽和的正丁醇，下層即為正丁醇飽和的水。

1.2.2 大豆皂甙的提取 稱取30.00g大豆，洗凈，加入150mL水浸泡12h，用濾網(wǎng)濾干大豆表面水分，并稱重。稱量好的大豆放入料理機(jī)，加入500mL水打磨，再用4層過濾網(wǎng)過濾。量取20mL豆?jié){濾液，以1∶5的比例加入75%的乙醇100mL，于80℃恒溫水浴鍋中提取5h。對(duì)提取液過濾，取濾液60mL置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，加入去離子水10mL溶解，并轉(zhuǎn)移入分液漏斗中，用40mL乙醚分兩次進(jìn)行脫脂，取下層、上層收集液加入10mL去離子水洗滌，棄去醚層，取下層，與之前下層合并。然后用水飽和過的正丁醇60mL分3次萃取，取上層，再用20mL正丁醇飽和的水洗滌萃取液，去上層，移入旋轉(zhuǎn)蒸餾瓶，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮干正丁醇后，用甲醇定容至10mL，備用。

1.2.3 影響大豆皂甙提取的單因素分析 根據(jù)相關(guān)資料報(bào)道及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，水浴提取的時(shí)間、溫度、豆?jié){與乙醇的配比、水飽和的正丁醇的使用量都是影響豆?jié){中皂甙制備的主要因素。因此以豆?jié){中皂甙含量為評(píng)價(jià)依據(jù)，考察提取時(shí)間、溫度、乙醇的濃度以及水飽和正丁醇的用量對(duì)皂甙提取的影響。

1.2.4 大豆皂甙提取條件的優(yōu)化 通過對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，確定以提取時(shí)間、提取溫度、豆?jié){與乙醇的配比以及水飽和的正丁醇用量作為主要因素，并且以豆?jié){中皂甙提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素四水平正交實(shí)驗(yàn)。選用L16(45)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取條件。實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 比色法測(cè)定大豆皂甙的含量 吸取已制備的皂甙100μL于試管中，放入60℃恒溫水浴振蕩器中揮去甲醇，分別在實(shí)驗(yàn)管和空白管加入香草醛－冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL。加蓋置于70℃水浴反應(yīng)15min。反應(yīng)完畢后，立即放入冰水中冷卻2min，再分別加入5mL乙酸乙酯?；靹蚝螅?58nm［6］處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算豆?jié){中皂甙的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 香草醛法測(cè)定豆?jié){皂甙及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用香草醛法對(duì)皂甙進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，香草醛－冰醋酸濃度、高氯酸用量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度都是影響吸光值不可忽視的因素，因此本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳的反應(yīng)條件并對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

采用齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確吸取0、100、200、300、400、500、600μL 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL具塞試管中，于60℃水浴中揮去甲醇，加入新配制的香草醛－冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL搖勻，70℃水浴保溫15min，取出后立即用冰水冷卻，加入5mL乙酸乙酯，搖勻。以不加標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白，558nm處測(cè)定吸光值。以吸光值和齊墩果酸濃度作圖，得到回歸方程:y=0.0013x－0.0073，R2=0.9987。如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2 水浴時(shí)間對(duì)皂甙提取量的影響

由圖2可見，提取液中皂甙含量隨著提取時(shí)間的增加呈先增大后降低的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為5h時(shí)濃度最高。在提取時(shí)間為1h時(shí)，由于提取時(shí)間不足，萃取不夠充分，因此提取液中皂甙含量偏低。而如果水浴時(shí)間達(dá)到7h，提取液中皂甙含量則呈下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殚L時(shí)間的高溫反應(yīng)，會(huì)使豆?jié){中皂甙的活性成分發(fā)生降解，故而提取出的皂甙含量降低。即最佳的提取時(shí)間為5h。

圖2 時(shí)間對(duì)提取皂甙含量的影響

2.3 水浴溫度對(duì)皂甙提取量的影響

由圖3可知，在初始升溫階段皂甙含量隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但當(dāng)水浴溫度達(dá)到90℃時(shí)，皂甙含量明顯降低。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，一開始溫度會(huì)對(duì)皂甙的提取起促進(jìn)作用，當(dāng)提取溫度超過80℃后會(huì)對(duì)豆?jié){中的活性成分——皂甙造成破壞，使其發(fā)生分解，所以皂甙含量會(huì)呈現(xiàn)急劇下滑的現(xiàn)象。即80℃為最佳提取溫度，此時(shí)的皂甙提取量最高。

圖3 溫度對(duì)提取皂甙含量的影響

2.4 豆?jié){與乙醇的配比對(duì)皂甙提取量的影響

由圖4可知，皂甙含量隨豆?jié){與乙醇的配比的增加成均勻上升趨勢(shì)，當(dāng)豆?jié){與乙醇的配比達(dá)到1∶7的時(shí)候，皂甙含量的增加趨勢(shì)趨于平緩。當(dāng)乙醇的量不充分時(shí)，未能充分提取豆?jié){中的活性物質(zhì)，而且提取液也不夠澄清，呈渾濁、多懸浮物狀。即確定最佳的豆?jié){與乙醇的配比為1∶5。

2.5 水飽和正丁醇的用量對(duì)皂甙提取量的影響

由圖5可知，提取液中皂甙含量隨著水飽和正丁醇用量的增加而增加，用量越多，萃取的皂甙含量越大，萃取也越充分，但隨著其萃取用量進(jìn)一步增加，提取液中皂甙含量的增加逐漸趨于平緩。正丁醇萃取法是將脫了脂的豆?jié){用乙醚萃取過后，用水飽和的正丁醇萃取，靜置，皂甙主要留在正丁醇相中，故水飽和正丁醇的用量越多，所萃取出的包含在正丁醇相中的皂甙含量就越多。當(dāng)水飽和正丁醇用量超過90mL時(shí)，對(duì)提取液中皂甙含量的影響就不顯著了。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

圖4 豆?jié){與乙醇配比對(duì)提取皂甙含量的影響

2.6 豆?jié){中皂甙提取條件的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)分析，選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、豆?jié){與乙醇配比及水飽和正丁醇用量進(jìn)行L16(45)正交實(shí)驗(yàn)［7］，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

極差分析結(jié)果表明(見表2)，影響提取液中皂甙含量的主次因素順序?yàn)锽＞C＞D＞A，即反應(yīng)時(shí)間＞豆?jié){與乙醇配比＞水飽和正丁醇用量＞反應(yīng)溫度。不考慮交互作用，提取豆?jié){中皂甙含量的較優(yōu)工藝條件為B2C3D3A2，即反應(yīng)時(shí)間為3h，豆?jié){與乙醇配比為1∶5，水飽和正丁醇為90mL，反應(yīng)溫度為75℃。由于因素A和因素D對(duì)提取豆?jié){中皂甙含量的影響很小，因此可確定14號(hào)實(shí)驗(yàn)即為實(shí)驗(yàn)較優(yōu)組合。此條件下，每100mL豆?jié){中含有的皂甙量為83.994mg。

在極差分析的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

圖5 水飽和正丁醇用量對(duì)提取皂甙含量的影響

3 結(jié)論

采用乙醇、正丁醇提取豆?jié){中皂甙，通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定豆?jié){中皂甙最優(yōu)提取工藝條件為:反應(yīng)時(shí)間為3h，豆?jié){與乙醇配比為1∶5，水飽和正丁醇為90mL，反應(yīng)溫度為75℃。此條件下豆?jié){中皂甙提取量為每100mL豆?jié){中含有皂甙量為89.668mg。

采用比色法測(cè)定豆?jié){中皂甙，以5%香草醛－冰乙酸溶液為顯色劑，顯色時(shí)間為15min、顯色溫度為70℃。在 558nm下測(cè)定，所得回歸方程為 y=0.0013x－0.0073，R2=0.9987，線性可靠，曲線高度顯著。此方法簡便快捷，適于實(shí)驗(yàn)室使用。

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Extraction and determination of the saponins in soybean milk

QIAO Zhao－yang，CAO Hui*，XU Fei
(Institute of Medical Equipment and Food，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

TS214.2

B

1002－0306(2010)08－0258－04

2009－08－28 *通訊聯(lián)系人

喬兆揚(yáng)(1986－)，男，在讀碩士，研究方向:食品質(zhì)量與安全。