胡曉冰，楊生玉，林標(biāo)聲

(1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封475001; 2.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開封475001; 3.福建省龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012)

不周氮源對丙酮酸分批發(fā)酵的影響及動力學(xué)模型的建立

胡曉冰1，2，楊生玉1，*，林標(biāo)聲1，3

(1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封475001; 2.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開封475001; 3.福建省龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012)

有機(jī)氮蛋白胨和無機(jī)氮(NH4)2SO4及其不同濃度進(jìn)行丙酮酸分批發(fā)酵，測定了菌體濃度、產(chǎn)物濃度和基質(zhì)濃度三項指標(biāo)，從而推導(dǎo)出細(xì)胞生長、產(chǎn)物生成和基質(zhì)消耗的發(fā)酵動力學(xué)方程和數(shù)學(xué)模型，其模擬曲線與實驗值較好地相吻合，為產(chǎn)業(yè)化設(shè)計和生產(chǎn)提供了可靠的保障。

丙酮酸，分批發(fā)酵，動力學(xué)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

光滑球擬酵母(T.glabrata)THD418 鹽酸硫胺素、生物素、鹽酸吡哚醇、煙酸等四種維生素的滲漏缺陷型菌株，河南大學(xué)生物工程實驗室保存;斜面培養(yǎng)基 酵母抽提物10g，蛋白胨20g，Glc 20g，蒸餾水1000mL，瓊脂2%;種子培養(yǎng)基 Glc 40g，蛋白胨5.00g，MgSO4·7H2O 0.30g，KH2PO41.00g，水1000mL，pH5.0;發(fā)酵培養(yǎng)基 Glc 106g，硫酸銨8g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCO340g，CaCl250mg，F(xiàn)eSO440mg，MnCl23mg，ZnCl 25mg，CuSO44mg，鹽酸硫銨素0.0125mg，鹽酸吡哆醇0.54mg，生物素0.022mg，煙酸9.7mg，水1000mL，pH5.0。

表1 兩種氮源發(fā)酵結(jié)果

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵方法 從新鮮斜面上接一環(huán)菌入種子培養(yǎng)基(100mL/500mL)錐形瓶，在30℃，220r/min下培養(yǎng)24h，以10%接種量接入發(fā)酵罐。7L發(fā)酵罐裝液量為4L，用5mol/L NaOH控制pH5.0，發(fā)酵溫度控制30℃，通氣量180～200L/h。

1.2.2 測定方法 發(fā)酵液生物量的測定采用光密度法;丙酮酸的測定采用硝酸鐵化學(xué)比色法;殘?zhí)呛康臏y定采用DNS法。

2 結(jié)果與分析

2.1 以蛋白胨和(NH4)2SO4分別作為氮源的分批發(fā)酵過程

為了研究發(fā)酵培養(yǎng)基中氮的含量及其性質(zhì)對菌體濃度、丙酮酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗的影響，用(NH4)2SO4作為無機(jī)氮源，蛋白胨作為有機(jī)氮源。將發(fā)酵培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4的濃度設(shè)定為6、8、10g/L(氮濃度分別1.272、1.696、2.12g/L)，對應(yīng)實驗批次表示B11，B12和B13;將發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨的濃度設(shè)為 13、17、21g/L(氮濃度分別為 1.3、1.7、2.1g/L)，同樣相應(yīng)實驗批次為B21，B22和B23。在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵，實驗結(jié)果見圖1和表1。

圖1 (a)(NH4)2SO4為氮源發(fā)酵結(jié)果

圖1 (b) 蛋白胨為氮源發(fā)酵結(jié)果

由圖1可以看出，細(xì)胞生長曲線0～16h為生長遲滯期，16～30h為指數(shù)生長期，細(xì)胞生長在32～40h達(dá)到穩(wěn)定生長期，此后細(xì)胞生長量基本維持不變或增長緩慢，56h達(dá)到最大。在以(NH4)2SO4作為氮源時，隨著其濃度的增加，光滑球擬酵母生物以較緩慢速率增加，菌體干重對(NH4)2SO4氮的平均得率為10.21g/g，但丙酮酸產(chǎn)量以較快的速率增加，丙酮酸產(chǎn)量對(NH4)2SO4的得率為36.26g/g;而以蛋白胨作為氮源時，隨著其濃度的增加，光滑球擬酵母以較快的速率增加，菌體干重對蛋白胨的得率為11.52g/g，但丙酮酸產(chǎn)量對蛋白胨的得率僅為34.56g/g。由此可以看出，無論有機(jī)氮源蛋白胨，還是無機(jī)氮源(NH4)2SO4都存在一個最適濃度。在(NH4)2SO4濃度為8g/L時，丙酮酸對葡萄糖的實際轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高的65.4%，丙酮酸產(chǎn)量為68.7g/L;而當(dāng)?shù)鞍纂说臐舛葹?7g/L時，丙酮酸對葡萄糖的實際轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高的60%，丙酮酸產(chǎn)量為61.5g/L。

2.2 動力學(xué)分析

2.2.1 菌體生長的動力學(xué)分析 描述菌體生長最常用的模型為Monod方程，它是基于以下假設(shè)建立的: a.菌體生長為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長，細(xì)胞成分只需要用一個參數(shù)即菌體濃度表示即可;b.培養(yǎng)基中只有一種底物是生長限制性底物，其它營養(yǎng)成分不影響微生物生長;c.將微生物生長視為簡單反應(yīng)，并假設(shè)菌體得率為常數(shù)，沒有動態(tài)滯后。顯然b、c不符合光滑球擬酵母發(fā)酵的特征，采用Monod方程有偏差。結(jié)合菌體生長的特性和多批次發(fā)酵結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該菌在發(fā)酵過程中，在一定發(fā)酵條件下，菌體的生長有一最大濃度，Logistic方程可以很好地解釋這一現(xiàn)象。Logistic模型是一個典型的S型曲線，能很好地反映分批發(fā)酵過程中因菌體濃度的增加對自身生長存在的抑制作用，能較好地擬合分批發(fā)酵過程的菌體生長規(guī)律。即:

對上式積分可得:

式中:μ為比生長速率，h－1;K為比生長速率系數(shù);CX為菌體濃度，g/L;C∞為最大菌體濃度，g/L。

應(yīng)用Origin7.0軟件的非線性方程Slogistic3，按實驗測定數(shù)據(jù)進(jìn)行最優(yōu)化擬合，如圖2和圖3所示，即光滑球擬酵母生長模型和動力學(xué)方程為:

a.無機(jī)氮:

圖2 無機(jī)氮細(xì)胞生長動力學(xué)擬合圖

b.有機(jī)氮:

圖3 有機(jī)氮細(xì)胞生長動力學(xué)擬合圖

由擬合曲線圖可知，無機(jī)氮實驗數(shù)據(jù)和曲線能夠很好的吻合，且最大菌體濃度和比生長速率系數(shù)K最大相對誤差均小于10%。由于初始接種量的問題，使得初始實驗值和模擬值存在較大誤差，即擬合方程中的b值。而有機(jī)氮擬合程度較差，應(yīng)該是營養(yǎng)物質(zhì)多，菌體生長不規(guī)律所致。

2.2.2 產(chǎn)物生成動力學(xué)分析 微生物產(chǎn)物形成過程非常復(fù)雜，為便于研究，Gaden根據(jù)產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長速率之間的關(guān)系，將其分為三種類型:a.相關(guān)模型;b.部分相關(guān)模型;c.非相關(guān)模型。由圖1可以看出，雖然丙酮酸是初級代謝產(chǎn)物，但是在實驗中的產(chǎn)物生成曲線對照菌種生成曲線來看，丙酮酸生成與細(xì)胞生長屬于部分偶聯(lián)型，這是因為光滑球擬酵母是營養(yǎng)滲漏缺陷型，需要一段時間進(jìn)行生物量的積累。因此選用b部分相關(guān)的Luedeking－Piret方程對丙酮酸的生成進(jìn)行動力學(xué)分析:

對式(9)進(jìn)行積分可得:

對式(10)代入數(shù)據(jù)計算可知，以(NH4)2SO4為氮源時:α1=2.60，β1=0.052h－1;以蛋白胨為氮源時: α2=5.22，β2=0.02h－1。由于 α2＞α1，說明以(NH4)2SO4為氮源時，發(fā)酵過程中丙酮酸合成與細(xì)胞生長之間耦聯(lián)程度要比蛋白胨為氮源時小一些。這主要是蛋白胨對于菌體濃度的影響要超過(NH4)2SO4，則:

無機(jī)氮丙酮酸生成動力學(xué)方程:

有機(jī)氮丙酮酸生成動力學(xué)方程:

式中:Cp為丙酮酸濃度，g/L;α為與生長相關(guān)聯(lián)的丙酮酸形成系數(shù)，g/g;β為非生長相關(guān)聯(lián)的丙酮酸形成系數(shù)，h－1。

為了驗證以上動力學(xué)分析的有效性，利用已知數(shù)據(jù)帶入方程來進(jìn)行丙酮酸產(chǎn)量時間的擬合，結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 無機(jī)氮丙酮酸生成動力學(xué)擬合圖

圖5 有機(jī)氮丙酮酸生成動力學(xué)擬合圖

由圖4和圖5可知，無機(jī)氮(NH4)2SO4的丙酮酸產(chǎn)量與時間的擬合圖擬合程度較好，而有機(jī)氮蛋白胨的丙酮酸產(chǎn)量與時間的擬合圖擬合程度并不是十分理想。原因是有機(jī)氮的產(chǎn)物生成與細(xì)胞濃度的關(guān)系較大，而在推導(dǎo)的過程中層層引入誤差的緣故。但是從整體變化趨勢上來看，有機(jī)氮和無機(jī)氮的產(chǎn)物—時間擬合圖都能夠反映出連續(xù)的產(chǎn)物生成，其動力學(xué)方程也表現(xiàn)出較好的實際意義。

2.2.3 葡萄糖消耗動力學(xué)分析 根據(jù)物料平衡，基質(zhì)消耗通常分為三部分，即用于菌體的生長、產(chǎn)物的消耗和細(xì)胞內(nèi)源維持的消耗。用微分方程表示的動力學(xué)模型:

將式(9)代入式(13)并化簡得:

將數(shù)據(jù)代入式(14)可得到葡萄糖消耗動力學(xué)方程。

無機(jī)氮的基質(zhì)消耗動力學(xué)方程:

有機(jī)氮的基質(zhì)消耗動力學(xué)方程:

式中:CS為葡萄糖濃度，g/L;YP/S為丙酮酸的最大收率系數(shù)，g/g;YX/S為酵母的最大收率系數(shù)，g/g;γ為維持系數(shù)，h－1。

為了驗證以上動力學(xué)分析的有效性，利用已知數(shù)據(jù)帶入式(14)來進(jìn)行丙酮酸產(chǎn)量時間的擬合。結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 無機(jī)氮葡萄糖消耗動力學(xué)擬合圖

圖7 有機(jī)氮葡萄糖消耗動力學(xué)擬合圖

由圖6和圖7可知，無論有機(jī)氮還是無機(jī)氮，動力學(xué)方程擬合程度都不是很出色，無機(jī)氮比有機(jī)氮擬合效果好一些，能夠描述基質(zhì)消耗的規(guī)律。

3 討論

所有酵母均能利用無機(jī)銨鹽，但是在以無機(jī)銨鹽為氮源的合成培養(yǎng)基上，目的產(chǎn)物的產(chǎn)出能力有很大差異。T.glabrata THD418在以硫酸銨為唯一氮源下能夠產(chǎn)生大量丙酮酸;而在復(fù)合蛋白胨培養(yǎng)基中，產(chǎn)酸能力有所下降。究其原因主要是蛋白胨中因純度不夠而含有維生素含量少，酵母膏中含有的各種維生素的量較多。T.glabrata THD418是維生素的滲漏型，培養(yǎng)基中維生素含量過高增大了丙酮酸向TCA循環(huán)以及其他支路的通量，導(dǎo)致丙酮酸積累減少［11］。

由動力學(xué)方程擬合圖可知，無機(jī)氮的三個動力學(xué)方程的擬合度要高于有機(jī)氮。細(xì)胞生成動力學(xué)、產(chǎn)物生成動力學(xué)方程擬合度要好于基質(zhì)消耗動力學(xué)方程。對于微生物來講，其整個反應(yīng)過程既包括細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)，也包括胞內(nèi)與胞外的物質(zhì)交換，還包括胞外的物質(zhì)傳遞過程。要對這樣一個復(fù)雜的體系進(jìn)行精確地描述幾乎是不可能的。特別是在分批發(fā)酵過程中建立機(jī)制模型幾乎是不可能［12－13］。為了工程上的應(yīng)用，首先要進(jìn)行合理的簡化，即在細(xì)胞的生長過程中，細(xì)胞內(nèi)各種成分均以相同的比例增加，視菌體為單組分，不考慮環(huán)境對菌體組成的影響。目前，國內(nèi)外生化研究所構(gòu)建的模型大多屬于數(shù)學(xué)擬合模型和正規(guī)模型，數(shù)學(xué)擬合模型應(yīng)用最為廣泛。這些模型從本質(zhì)上講是對分批發(fā)酵過程總體現(xiàn)象和行為的描述，是一種現(xiàn)象模型。從工程角度出發(fā)，建立模型是為了更深刻地了解微生物復(fù)雜的反應(yīng)本質(zhì)，即是在于使用模型，建立最優(yōu)的操作條件，并為反應(yīng)器的優(yōu)化和控制服務(wù)。一個好的現(xiàn)象模型必須具備兩個特征:a.模型能夠定量地描述發(fā)酵過程的變化;b.主要影響因子的作用能夠在模型中反映出來［14］。本研究所建立的動力學(xué)模型基本具備以上兩個特征，能較好地描述光滑球擬酵母THD418發(fā)酵過程的變化，特別是細(xì)胞生長模型和產(chǎn)物生成動力學(xué)模型，但基質(zhì)消耗的動力學(xué)方程的模型預(yù)測值與實驗值有一定的偏離，這可能是由多種原因造成的，如基質(zhì)的組成成分、基質(zhì)對產(chǎn)物的抑制作用、菌體的自溶和不利的外界條件等對產(chǎn)物生成的影響等。因此，需要在以后的研究中根據(jù)基質(zhì)對產(chǎn)物的抑制作用、基質(zhì)的消耗規(guī)律不斷去修正所建立的動力學(xué)模型。

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Effect of different nitrogen forms on fermentation of pyruvate in batch process and kinetic modeling

HU Xiao－bing1，2，YANG Sheng－yu1，*，LIN Biao－sheng1，3
(1.Bioengineering Institute＆College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475001，China; 2.Department of Enviroment and Chemistry Engineering，Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475001，China; 3.College of Life Science of Longyan University，Longyan 364012，China)

The effects of two different nitrogen sources，peptone and(NH4)2SO4on the growth of pyruvate production in batch fermentations were investigated.During fermentation of pyruvate，the measurement of cell concentration，pyruvate concentration and glucose concentration were taken.Based on the indexes above，kinetic equations and mathematical modes of cell growth，pyruvate production and substrate consumption were proposed.The simulation curve coincideed well with experiment values，which would offer assurance for the industrial design and production of pyruvate.

pyruvate;batch fermentation;kinetic

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0160－05

微生物反應(yīng)是非常復(fù)雜的反應(yīng)過程:在整個反應(yīng)體系中有細(xì)胞的生長、基質(zhì)的消耗和產(chǎn)物的生成，并且有各自的最佳反應(yīng)條件;微生物反應(yīng)有多種代謝途徑，微生物反應(yīng)過程中，細(xì)胞形態(tài)和組成要經(jīng)歷生長、繁殖、維持、死亡等若干階段，不同菌齡有不同的活性。而微生物動力學(xué)就是研究各種發(fā)酵過程變量在活細(xì)胞中變化的規(guī)律，以及各種發(fā)酵條件對這些變量變化速度的影響。通過動力學(xué)的分析，更加深入地認(rèn)識和掌握發(fā)酵過程，為工業(yè)發(fā)酵的模擬、優(yōu)化和控制打下基礎(chǔ)。其研究方法就是以數(shù)學(xué)模型定量描述發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速率、基質(zhì)利用速率和產(chǎn)物生成速率等因素的變化。近年來，丙酮酸作為一種重要的食品添加劑和酸味劑，特別是在減肥食品中的應(yīng)用，使得其研究生產(chǎn)成為熱點。而微生物法發(fā)酵丙酮酸的研究已經(jīng)較為深入，各個因素對于丙酮酸發(fā)酵影響屢見報道［1－8］。但是，對于氮源的種類及其濃度對丙酮酸發(fā)酵的動力學(xué)分析尚未進(jìn)行深入探討。本文分別以蛋白胨和(NH4)2SO4作為氮源［9］，研究它們對T.glabrata THD418產(chǎn)丙酮酸分批發(fā)酵的影響，并對發(fā)酵過程中的菌體濃度、丙酮酸生成和葡萄糖的消耗進(jìn)行動力學(xué)分析［10］。

2009－05－08 *通訊聯(lián)系人

胡曉冰(1981－)，男，碩士研究生，助教，研究方向:工業(yè)微生物育種及食品發(fā)酵。