李 強(qiáng)，唐 微，石園園，李嘉惠，李艷紅，劉 悅（鄖陽醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000）

蒽酮-硫酸法和3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定杜仲水提液多糖含量

李 強(qiáng)，唐 微，石園園，李嘉惠，李艷紅，劉 悅（鄖陽醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000）

采用蒽酮-硫酸法測(cè)定杜仲水提液中總糖含量，3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定杜仲水提液中單糖含量，多糖含量為總糖與還原糖含量之差。該法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，為其他材料水提液中多糖定量提供參考。

蒽酮-硫酸法，3，5-二硝基水楊酸法，杜仲，水提液，多糖

Abstract：The concentration of total sugar in water extraction from Eucommia ulmoides Oliver was determined by anthrone-sulfuric method，while the concentration of reducing sugar was determined by DNS method，however the concentration of polysaccharide depended on their concentration difference.The results showed that the methods were convenient，rapid，accurate and stable.It provided some references for determination of polysaccharide in water extraction from the other meterials.

Key words：anthrone-sulfuric method；3，5-dinitrosalicylic acid method；Eucommia ulmoides Oliver；water extraction；polysaccharide

多糖是由多個(gè)單糖分子脫水、縮合所組成的高分子化合物，廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中，是構(gòu)成生命活動(dòng)的四大基本物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗炎癥、抗病毒、抗凝血、降血糖、抗衰老等作用［1］。近年來，多糖已成為保健食品和醫(yī)藥行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。多糖提取工藝的優(yōu)化是多糖產(chǎn)品研究與開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。多糖提取工藝有溶劑浸提法、酶法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等［2］。對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行研究時(shí)，需要對(duì)不同工藝條件下水提液多糖含量進(jìn)行測(cè)定，以多糖得率為指標(biāo)確定最優(yōu)提取工藝。為避免單糖影響多糖得率，一般對(duì)水提液進(jìn)行醇沉，溶解后進(jìn)行多糖定量。若直接對(duì)水提液進(jìn)行多糖測(cè)定可簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程。受原材料處理、溶液pH、水提溫度等因素影響，水提液中可能存在單糖干擾，采用蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法只能測(cè)定總糖含量。3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）［3］可測(cè)定多糖水提液的總糖和還原糖，多糖含量以總糖和還原糖之差表示，能去除單糖干擾，但制備總糖試液需濃HCl水解樣品，較費(fèi)時(shí)，繁瑣，且浪費(fèi)樣品。本實(shí)驗(yàn)以杜仲為原料，采用蒽酮-硫酸法和DNS法分別測(cè)定杜仲水提液中總糖和還原糖含量，以總糖和還原糖之差表示多糖含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲 購于十堰市中藥材公司，產(chǎn)地湖北；葡萄糖 上?；瘜W(xué)試劑分裝廠；蒽酮 上海試劑一廠；3，5-二硝基水楊酸 湖州市菱湖望菱試劑廠；其他試劑 為國產(chǎn)分析純。

MP120-2型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；HH·SY11-Ni型電熱恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；722S型可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取烘干至恒重的葡萄糖0.100g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL，得濃度為100mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，如法配制濃度為1000mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 蒽酮試劑的配制 精確稱取蒽酮2.000g，用98%濃硫酸溶解并定容至1000mL。

1.2.3 DNS試劑的配制 精確稱取6.5g 3，5-二硝基水楊酸溶于少量熱水，移入1000mL容量瓶，加入2mol/L氫氧化鈉溶液325mL，再加入丙三醇45g，搖勻，定容至1000mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 杜仲水提液的制備 杜仲烘干，粉碎，過40目篩，加入15倍85%乙醇，82℃回流脫脂2h，真空抽濾并用85%乙醇沖洗6次，烘干備用。精確稱取備用杜仲粉40g，加入15倍水，90℃提取2h得到杜仲水提液。

1.3.2 總糖和還原糖供試液的制備 取一定量杜仲水提液準(zhǔn)確稀釋30倍，稀釋液作為總糖供試液。未稀釋杜仲水提液作為還原糖供試液。

1.3.3 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用蒽酮-硫酸法［4］。精確量取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/L）于6支試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1mL，搖勻后分別加入5mL蒽酮試劑，混勻后置于沸水浴中加熱6min，取出冷卻至室溫，以空白管為對(duì)照，在620nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用DNS法［5］。分別精密吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1000mg/L），加入8個(gè)25mL容量瓶中，加水至總體積為2.5mL，再分別加入3mL DNS試劑，混勻后置于沸水浴中加熱5min，取出后立即冷卻至室溫，加水定容至25mL，搖勻后，以空白管為對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 多糖含量計(jì)算 多糖含量=總糖含量-還原糖含量

1.3.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取總糖和還原糖供試液6份各1mL，分別按1.3.3項(xiàng)和1.3.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，考察蒽酮-硫酸法和DNS法的精密度。

1.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取總糖供試液1mL，按1.3.3項(xiàng)下方法操作，在 0、10、20、30、60、90min 測(cè)定吸光度，考察蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性。取還原糖供試液1mL，按1.3.4 項(xiàng)下方法操作，在0、10、20、30、40、50、60、90min測(cè)定吸光度，考察DNS法穩(wěn)定性。

1.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取總糖含量為53.72mg/L的杜仲水提液6份各0.5mL，各精密加入100mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液0.5 mL，按1.3.3項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度并計(jì)算蒽酮-硫酸法回收率。精密吸取還原糖濃度為596.40mg/L的杜仲水提液6份各0.6mL，各精密加入1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液0.6mL，按1.3.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度并計(jì)算DNS法回收率。

1.3.9 杜仲水提液多糖含量測(cè)定 取6份杜仲水提液，按1.3.3項(xiàng)和1.3.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，以1.3.5項(xiàng)下方法計(jì)算水提液多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，線性回歸方程為：y=192.56x-0.3867，R2=0.9999，說明葡萄糖濃度在20～100mg/L范圍內(nèi)線性良好。

2.2 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，線性回歸方程為：y=4326.2x+101.01，R2=0.9997，說明葡萄糖濃度在200～1400mg/L范圍內(nèi)線性良好。

圖1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表1和表2，表明蒽酮-硫酸法測(cè)定總糖和DNS法測(cè)定還原糖精密度良好。

表1 蒽酮-硫酸法測(cè)定總糖精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 DNS法測(cè)定還原糖精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表3和表4，表明蒽酮-硫酸法測(cè)定總糖顯色在90min內(nèi)較穩(wěn)定，DNS法測(cè)定還原糖顯色在30min內(nèi)較穩(wěn)定。

表3 蒽酮-硫酸法測(cè)定總糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 DNS法測(cè)定還原糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表5和表6，表明蒽酮-硫酸法測(cè)定總糖和DNS法測(cè)定還原糖加樣回收率較好。

表5 蒽酮-硫酸法測(cè)定總糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 DNS法測(cè)定還原糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 杜仲水提液多糖含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 杜仲水提液多糖含量測(cè)定

結(jié)果見表7，表明采用蒽酮-硫酸法和DNS法測(cè)定杜仲水提液中多糖結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

3 結(jié)論

杜仲經(jīng)乙醇回流預(yù)處理，水提液中仍有大量單糖，本實(shí)驗(yàn)用蒽酮-硫酸法和DNS法分別測(cè)定水提液中總糖和還原糖含量，多糖含量為總糖與還原糖含量差值，排除了單糖干擾，測(cè)得準(zhǔn)確的多糖含量。此法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適于杜仲水提液多糖定量，為其他材料水提液多糖定量提供參考。

［1］丁保金，金麗琴，呂建新.多糖的生物活性研究進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，2004，39（8）：561-564.

［2］尹艷，高文宏，于淑娟，等.多糖提取技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（2）：248-250.

［3］李衛(wèi)彬，陽文輝，黃鎖義，等.當(dāng)歸總糖、還原糖和多糖的含量測(cè)定方法探討［J］.微量元素與健康研究，2008，25（3）：46-47.

［4］王憲澤.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：52-54.

［5］宋俊英.茶薪菇總糖、還原糖和多糖的測(cè)定［J］.中草藥，2006，37（9）：1421-1422.

Determination of polysaccharide in water extraction from Eucommia u/moides Oliver by 3，5-dinitrosalicylic acid（DNS）method and anthrone-sulfuric method

LI Qiang，TANG Wei，SHI Yuan-yuan，LI Jia-hui，LI Yan-hong，LIU Yue
（Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）

TS207.3

A

1002-0306（2010）10-0370-03

2009-11-10

李強(qiáng)（1979-），男，碩士，講師，主要從事生物活性成分研究?；痦?xiàng)目：鄖陽醫(yī)學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目（2006QDJ06）。