李玉鳳，張謙華，林雀躍，朱 韜，何頌華，趙立春，*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧 530021）

玉葉金花是茜草科植物玉葉金花（Mussaenda pubescensAit.F.）的干燥根及莖，具有清熱解毒，利濕消腫的功效[1-2]，常被用于治療各種炎癥并發(fā)癥，如感冒、咽喉炎、腎炎水腫、支氣管炎、腸炎腹瀉等，目前市場上的產(chǎn)品有玉葉清火片、玉葉清火膠囊，玉葉解毒顆粒等[3-5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，玉葉金花中含有多種化學(xué)成分，如皂苷類、單萜類、苯丙素類等[5]。本課題前期對玉葉金花的石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位進(jìn)行了活性篩選，研究發(fā)現(xiàn)玉葉金花的乙酸乙酯、正丁醇、水部位均有一定的抗炎作用，而目前對玉葉金花乙酸乙酯部位化合物的研究較少，故本研究對乙酸乙酯部位中的4種咖啡?？鼘幩犷惢衔镞M(jìn)行抗壓活性篩選，為玉葉金花的進(jìn)一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

1）分析天平（梅特勒百萬分之一，瑞士）；2）培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；3）酶標(biāo)儀（BioTek，德國）；4）倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本）；5）超凈臺（ATRTECH，日本）；5）離心機(jī)（湘儀，湖南）。

1.2 材料

1）小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞由廣西中醫(yī)藥大學(xué)楊世林團(tuán)隊(duì)提供；2）綠原酸（純度＞96.6%）、異綠原酸A（純度＞97.3%）、異綠原酸C（純度＞94.1%）購自中國食品藥品檢定研究院；3）異綠原酸B（純度＞98.6%）購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；4）培養(yǎng)基、胎牛血清（gibco，美國）；5）LPS、MTT（SIGMA，美國）；6）ELISA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；7）24、96孔板（潔特，廣州）。

2 方法

2.1 體外抗炎試驗(yàn)

2.1.1 RAW246.7細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存 1）細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)：從-80 ℃冰箱中取出細(xì)胞凍存管，迅速置37 ℃的水浴鍋中，盡量使凍存管中的凍存物在1 min內(nèi)迅速溶解，避免時間過長導(dǎo)致細(xì)胞受損，因?yàn)榧?xì)胞在-5 ℃～0 ℃時最容易受損。因此，此部分的實(shí)驗(yàn)操作尤為關(guān)鍵。然后，迅速打開凍存管將細(xì)胞懸液移入提前準(zhǔn)備好的10% FBS（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以下統(tǒng)一用10%FBS）培養(yǎng)基中，用移液槍吹打幾下混勻，800 r·min-1離心5 min，棄去上清，加入2 mL的10% FBS培養(yǎng)基至細(xì)胞沉淀中，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞30次左右，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到加有3 mL10% FBS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2）細(xì)胞傳代：待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時，棄去培養(yǎng)液，用2 mL PBS清洗2～3遍，加入2 mL培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，800 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用2 mL含10%FBS培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮，輕輕吹打均勻，按照1傳2接種到新的培養(yǎng)瓶中，然后每瓶再加入3 mL的10%FBS 培養(yǎng)放置培養(yǎng)箱種繼續(xù)培養(yǎng)。3）細(xì)胞凍存：首先配制細(xì)胞凍存液，取1個15 mL的無菌離心管，按DMSO:FBS=1:9的比例進(jìn)行配制，備用。其次，將裝有異丙醇的凍存盒放到37 ℃水浴鍋中。細(xì)胞的收集同前期，將配好的凍存液加入裝有細(xì)胞的離心管中，輕輕吹打混勻，每個凍存管1 mL，使用封口膜將凍存管封口，在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、凍存日期、凍存人姓名。將凍存管放入凍存盒中，置-80 ℃冰箱凍存，第2天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期凍存。

2.1.2 炎癥細(xì)胞模型建立 取對數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞，細(xì)胞的收集同前期。加入1 mL10% FBS培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸，采用計(jì)數(shù)板（“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的原則）在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每毫升2×105個的密度接種于 96 孔板中，每孔100 μL，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。棄去舊培養(yǎng)基，正常對照組每孔加入100 μL的1% FBS培養(yǎng)基，LPS模型組加入終濃度為1 μg·mL-1的LPS誘導(dǎo)24 h[6]，每組設(shè)3個復(fù)孔，誘導(dǎo)完成后，收集細(xì)胞上清液，采用Griess試劑盒檢測細(xì)胞上清中NO表達(dá)水平，以確定LPS誘導(dǎo)炎癥模型是否構(gòu)建成功。

2.1.3 MTT法測定細(xì)胞毒性 實(shí)驗(yàn)分為空白組和給藥組。給藥組為終濃度為20 μm、40 μm、60 μm、80 μm、100 μm的綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的稀釋液。取對數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞，細(xì)胞的收集同前期，以2×105個/mL，的密度接種于 96 孔板中，每孔100 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄去舊培養(yǎng)基，空白組每孔加入100 μL 1%FBS培養(yǎng)基，給藥組每孔加入100 μL相應(yīng)的藥物稀釋液，每組設(shè)3個復(fù)孔，孵育24 h。24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL MTT 溶液5 mg·mL-1以及90 μL DMEM培養(yǎng)液，避光孵育4 h后，以3000 r·min-1離心10 min，棄去上清，每孔加100 μL DMSO，置搖床上輕輕搖晃15 min，采用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定其吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞相對存活率。相對存活率=實(shí)驗(yàn)組/空白組×100%。

2.1.4 Griess試劑測定NO釋放量 實(shí)驗(yàn)分為空白組、LPS模型組、給藥組。取對數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞，以每毫升2×105個的密度接種于 96 孔板中，每孔100 μL，置培養(yǎng)箱中孵育12 h后，棄去舊培養(yǎng)基，空白組與LPS模型組每孔加入50 μL 1%FBS培養(yǎng)基，給藥組每孔加入50 μL相應(yīng)的藥物稀釋液（給藥濃度設(shè)置同MTT項(xiàng)下），每組設(shè)3個復(fù)孔。孵育1 h后，空白組加入50 μL 1%FBS，LPS模型組與給藥組每孔加入50 μL終濃度為1 μg·mL-1的LPS，誘導(dǎo)24 h后，分別吸取每孔細(xì)胞上清40 μL置新的96孔板中，每孔加入40 μL Griess試劑，避光孵育30 min，采用酶標(biāo)儀測定540 nm處OD值。

2.1.5 ELISA測定IL-6和TNF-α的釋放量 實(shí)驗(yàn)分為空白組、LPS模型組、給藥組。給藥組為終濃度為 20 μm、40 μm、60 μm、80 μm、100 μm 的異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的稀釋液。取對數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞，以每毫升2×105個的密度接種于24孔板中，每孔500 μL，置培養(yǎng)箱中孵育12 h后，棄去舊培養(yǎng)基，空白組與LPS模型組每孔加入250 μL 1%FBS培養(yǎng)基，給藥組每孔加入250 μL相應(yīng)的藥物稀釋液，每組設(shè)3個復(fù)孔。孵育1 h后，空白組加入250 μL 1%FBS，LPS模型組與給藥組每孔加入 250 μL 終濃度為 1 μg·mL-1的LPS，誘導(dǎo)24 h后，收集細(xì)胞上清，采用ELISA試劑盒測定IL-6和TNF-α的OD值。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用GraphPad Prism 6.04軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析對樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

3.1.1 炎癥細(xì)胞模型的建立 Griess結(jié)果顯示，與空白對照組比較，經(jīng)1.0 μg·mL-1的LPS 誘導(dǎo)后，LPS模型組的NO表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），表明炎癥模型構(gòu)建成功（見表1）。因此，以下實(shí)驗(yàn)均采用1.0 μg·mL-1LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞來構(gòu)建炎癥模型。

表1 LPS對RAW246.7細(xì)胞NO表達(dá)的影響（n = 3）

3.1.2 MTT測定細(xì)胞毒性 MTT結(jié)果顯示，與空白組比較，4種有機(jī)酸類化合物在終濃度為20 μm、40 μm、60 μm、80 μm、100 μm 的給藥條件下，對細(xì)胞的存活力均無影響（見圖1），表明在藥物在0 μm～100 μm濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性作用，因此采用0 μm～100 μm濃度進(jìn)行抗炎活性研究。

圖1 4種有機(jī)酸對RAW264.7 細(xì)胞存活力的影響

3.1.3 Griess試劑測定NO的釋放 Griess結(jié)果顯示（見圖2），與空白組比較，LPS模型組的NO的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而4種有機(jī)酸化合物處理后均能顯著降低NO的釋放。其中，異綠原酸B對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO的抑制作用較為明顯，其在濃度為20 μm已表現(xiàn)出極顯著的抑制作用（P＜0.0001），而綠原酸只有在高濃度下可以抑制NO的釋放。因此，推測異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C這3種有機(jī)酸類是玉葉金花發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分。3.1.4 ELISA測定IL-6和TNF-α的釋放 采用ELISA法測定IL-6和TNF-α的釋放量，結(jié)果如圖3所示，給藥濃度為20 μm時，異綠原酸A和異綠原酸C對抑制IL-6的釋放效果不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在40 μm、60 μm時，以上3種有機(jī)酸均可以極顯著地抑制IL-6的釋放（P＜0.000 1）。此外，研究發(fā)現(xiàn)3種有機(jī)酸對TNF-α均沒有抑制作用。

圖2 4種有機(jī)酸對LPS誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞 NO表達(dá)的影響

圖3 異綠原酸A、B、C對LPS誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

4 討論

玉葉金花臨床用于治療感冒及各種炎癥，主要功能與炎癥相關(guān)。目前已報道的玉葉金花中具有抗炎活性的化合物有咖啡酰甲酯、musseandoside R、musseandoside Q、musseandoside G、musseandoside U、玉葉金花苷酸甲酯[7-8]。因此對玉葉金花的抗炎活性研究具有重要意義。

LPS是刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的有效物質(zhì)，可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為梭形巨噬細(xì)胞分泌多種促炎性因子，如NO、IL-6，IL-1β，TNF-α等[9-10]。NO則是一種重要的炎癥介質(zhì)，在炎癥早期可以起到保護(hù)機(jī)體的作用，由于過量的NO與超氧陰離子O2-反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽促使炎癥發(fā)生[11]。本研究發(fā)現(xiàn)綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C這4種有機(jī)酸類化合物對NO均具有一定的抑制作用，此外異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C也可明顯抑制IL-6的釋放，其中異綠原酸B對炎癥因子NO及IL-6的抑制作用最顯著。因此，本研究認(rèn)為咖啡?？鼘幩犷惢衔锏捏w外抗炎活性與化合物的結(jié)構(gòu)存在一定的關(guān)系。

綜上所述，本研究認(rèn)為各抗炎成分間通過協(xié)同作用達(dá)到玉葉金花抗炎的效果，其具體的抗炎作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。