中醫(yī)藥治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力作用機(jī)制研究進(jìn)展

張藝?yán)_，王百通，呂志國，張冬梅，徐 鵬，吳 桐，劉 淼，吳 雷，陳助明，王 健*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種典型的由自身抗體介導(dǎo)引起的發(fā)生在神經(jīng)肌肉接頭處（neuromuscular junction，NMJ）的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為骨骼肌肌肉無力和易疲勞，其特點(diǎn)是晨輕暮重，活動(dòng)后加重、休息后可減輕[1]。一項(xiàng)大型研究報(bào)告指出發(fā)病率1.55/10萬，流行率3.66/10萬[2]，發(fā)病高峰出現(xiàn)在年輕的成年女性和老年男性[3]。

在發(fā)病機(jī)制上，乙酰膽堿受體（AChR）抗體陽性占據(jù)大多數(shù)，大約80%的MG患者中發(fā)現(xiàn)AChR抗體呈陽性。且在這類患者中AChR-α亞基陽性＞50%[4]。大約7%～10%的MG患者和高達(dá)40%的AChR抗體陰性的全身性MG患者中發(fā)現(xiàn)了肌肉特異性受體酪氨酸激酶（MuSK）抗體[5]。2%～50%的雙血清陰性MG患者中低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（Lrp4）抗體呈陽性[6]。

目前，MG的治療仍以膽堿酯酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主，近年來靶向生物制劑逐漸興起，被行業(yè)內(nèi)所認(rèn)可，靜脈注射免疫球蛋白、血漿置換以及胸腺切除以其治療成本高及創(chuàng)傷大等原因很少被廣泛應(yīng)用于臨床[7]。然西醫(yī)的治療多是對癥治療，治標(biāo)而不治本，且多有毒副作用，治療后患者多反復(fù)，研究表明，中醫(yī)藥不僅對本病有較好的療效,而且已形成自己的鮮明特色，并能較好地在實(shí)踐中應(yīng)用[8]。近年來，中醫(yī)藥治療MG作用機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)，回顧總結(jié)中醫(yī)藥對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）作用機(jī)制的研究進(jìn)展，為治療MG中藥新藥的開發(fā)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供思路，為中醫(yī)藥治療MG臨床應(yīng)用提供更可靠的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）動(dòng)物模型制備方法

回顧總結(jié)近10年中英文文獻(xiàn)，在造模動(dòng)物種屬選擇上都選的是大鼠或小鼠，品系C57BL/6小鼠和Lewis大鼠，性別都是選用雌性。在納入的研究中造模制備方法共有四種：1）采用人工合成鼠源性AchR-α亞基97-116肽段通過構(gòu)建EAMG模型應(yīng)用最多。每200 μL含AchR-α亞基97-116肽段50 μg、結(jié)核分枝桿菌H37Ra干粉1 mg，多點(diǎn)皮下注射于造模鼠的肩背部、尾基部、足墊部，第2、3次加強(qiáng)免疫將與不完全弗氏佐劑（IFA）充分混勻含AchR-α亞基 97-116肽段 50 μg、結(jié)核分枝桿菌H37Ra干粉1 mg，在相同部位注射強(qiáng)化免疫。2）采用將人工合成AchRα1（129-145）多肽片段按照1/2的比例與CFA完全乳化，配比按照200 μL溶液內(nèi)含有50 μg多肽片段，皮下注射。3）利用免疫親和層析技術(shù)從美國加州電鰩（torpedo of Californica）的電器官中提取、純化乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR），并將純化的AchR與完全福氏佐劑（CFA）以50 μg:200 μL的比例混合，制備成免疫原，在動(dòng)物的背部、后足趾、尾根部選擇多個(gè)注射點(diǎn)分2～3次免疫小鼠。4）收集初診或近一個(gè)月內(nèi)未服用過激素類藥物的MG患者血液，將分離出的血清每次0.8 mL注入免疫小鼠，連續(xù)7 d，制備MG患者血清被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型。

2 改善T淋巴細(xì)胞免疫失衡機(jī)制的研究

雷公藤用于各種自身免疫性疾病的治療已得到廣泛認(rèn)可，劉蘭濤等[9]在研究雷公藤多苷時(shí)發(fā)現(xiàn)可降低EAMG模型大鼠胸腺T細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）BVmRNA的表達(dá)，從而緩解EAMG癥狀。陳偉[10]研究人參皂苷Rb1（G-rb1）對EAMG模型大鼠影響發(fā)現(xiàn)其可通過上調(diào)CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量來緩解癥狀。朱潔等[11]研究表明升陷湯可能通過升高EAMG大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞含量，降低CD4+/CD8+的比例，而起到治療作用。吳周燁等[12]采用益氣升提法治療EAMG模型大鼠，發(fā)現(xiàn)其可提高CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，降低IFN-γ、IL-17含量，以減少神經(jīng)肌肉接頭處AchR損害。張運(yùn)克等[13]研究顯示補(bǔ)脾益腎起痿湯通過影響輔助性T細(xì)胞平衡，拮抗炎癥反應(yīng)，減輕肌無力癥狀的作用。徐鵬[14]根據(jù)王健教授提出的健脾益氣補(bǔ)髓方進(jìn)行EAMG動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明健脾益氣補(bǔ)髓方可抑制EAMG大鼠CD4+T細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Thl細(xì)胞分化數(shù)量，上調(diào)Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞分化數(shù)量，改善了Thl/Th2/Thl7細(xì)胞免疫失衡。

3 改善B淋巴細(xì)胞免疫失衡機(jī)制的研究

許夢賢[15]闡述益氣升提法治療EAMG大鼠的作用機(jī)制既通過下調(diào)CD4、上調(diào)Foxp3的表達(dá)影響T淋巴細(xì)胞，減少AchR-Ab的產(chǎn)生，又通過上調(diào)CD19的表達(dá)，減少IL-10的表達(dá)水平，影響B(tài)淋巴細(xì)胞群，改變B淋巴細(xì)胞系的平衡。

4 調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌機(jī)制的研究

金碩果等[16]研究癱痿膠囊發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，癱痿膠囊可顯著下調(diào)EAMG小鼠外周血清中高表達(dá)的白細(xì)胞介素4（IL-4）水平，使EAMG小鼠外周血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）表達(dá)水平較模型組水平升高，結(jié)果表明癱痿膠囊治療EAMG機(jī)制可能是通過下調(diào)血清中細(xì)胞因子IL-4，上調(diào)TGF-β水平，改善免疫耐受等，進(jìn)一步改善EAMG小鼠的臨床癥狀。牛鳳云[17]認(rèn)為MG基本病機(jī)為脾胃虛損、氣血虧虛，治療應(yīng)遵循健脾補(bǔ)氣、升陽益損，臨床應(yīng)用肌力康飲中藥復(fù)方治療MG，實(shí)驗(yàn)研究[17]表明肌力康飲降低EAMG大鼠血清中AchR-Ab的水平，與模型組比較肌力康飲各劑量組中EAMG大鼠血清中TGF-β水平明顯升高，說明肌力康飲有助于TGF-β的提高，從而達(dá)到治療作用。李春紅等[18]基于溫腎活血、益氣升清的理論基礎(chǔ)，提出益筋方對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）小鼠的治療作用在于可顯著降低白細(xì)胞介素2（IL-2）的表達(dá)水平，從而增加EAMG小鼠體質(zhì)量，減輕癥狀。邵錦根等[19]應(yīng)用復(fù)方參芪合劑干預(yù)EAMG大鼠，研究指出復(fù)方參芪合劑能改善EAMG病情，其機(jī)制可能為下調(diào)干擾素-7（IFN-7）、白細(xì)胞介素4（IL-4）的比例，上調(diào)白細(xì)胞介素10（IL-10）的比例而使T細(xì)胞分化趨于平衡。張新欣等[20]發(fā)現(xiàn)小劑量的青蒿琥酯明顯降低腫瘤壞死因子TNF-α細(xì)胞的數(shù)量，抑制TNF-α的分泌表達(dá)，延遲免疫應(yīng)答的同時(shí)增強(qiáng)免疫耐受，已達(dá)到治療疾病的作用。王洪峰等[21]研究發(fā)現(xiàn)“溫陽補(bǔ)氣”針法治療EAMG機(jī)制在于降低EAMG大鼠血清IL-12和IL-18的表達(dá)水平。鄒瑩等[22]根據(jù)裘昌林教授的經(jīng)驗(yàn)對馬錢子膠囊治療MG作用開展大鼠實(shí)驗(yàn)研究，其可能通過調(diào)節(jié)EAMG大鼠血清中TGF-β水平改變機(jī)體免疫抑制和激活的穩(wěn)態(tài)，改善EAMG大鼠的免疫功能。鄧鍇等[23]運(yùn)用況時(shí)祥教授提出的補(bǔ)脾強(qiáng)力復(fù)方治療EAMG大鼠發(fā)現(xiàn)補(bǔ)脾強(qiáng)力復(fù)方能有效降低EAMG大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17水平，升高TGF-β水平，從而糾正EAMG大鼠Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子失衡。

5 改善骨骼肌、線粒體、神經(jīng)肌肉接頭處超微結(jié)構(gòu)的研究

劉友章[24]根據(jù)因地制宜、“南藥治南病”的指導(dǎo)思想，總結(jié)出健脾祛濕方，實(shí)驗(yàn)研究表明該方不僅可使電鏡下觀察到的EAMG大鼠肌肉肌纖維稀疏、紊亂、線粒體減少的超微結(jié)構(gòu)得以改善，同時(shí)健脾祛濕方還可改善EAMG大鼠神經(jīng)肌肉接頭處的皺折局部紊亂、溶解、消失，突觸前膜囊泡減少等狀態(tài)。胡芳玉[25]，雷孝文[26]依據(jù)團(tuán)隊(duì)“脾-線粒體”相關(guān)學(xué)說開展實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)健脾益氣法治療EAMG模型大鼠后，其骨骼肌、線粒體及神經(jīng)肌肉接頭處超微結(jié)構(gòu)均得到明顯改善，并且可明顯調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)通路蛋白過氧化物酶增殖激活受體γ-輔助激活因子-1α（PGC-1α）、細(xì)胞核呼吸因子1（NRF1）及線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（Tfam）的mRNA表達(dá)，以此改善EAMG癥狀。

6 小結(jié)與展望

中醫(yī)藥治療EAMG機(jī)制的研究，最多的是從調(diào)節(jié)促炎或抑炎細(xì)胞因子分泌的角度出發(fā)，包括可降低促炎因子 IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、TNF-α 等的表達(dá)水平，升高抑炎因子TGF-β、IL-10的分泌。而這些促炎或抑炎細(xì)胞因子都是由T細(xì)胞不同亞群分泌的，故有研究從調(diào)節(jié)Thl/Th2/Thl7/Treg細(xì)胞免疫平衡方向探究中醫(yī)藥的作用機(jī)制。重癥肌無力是由T細(xì)胞介導(dǎo)和B細(xì)胞依賴，細(xì)胞和體液免疫均參與的自身免疫性疾病[27]，自身抗體應(yīng)答主要由CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。CD4+T細(xì)胞可分化不同T輔助（Th）細(xì)胞亞群，包括Th1，Th2，Th17，T濾泡輔助（Tfh）細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞，這些均已被證明參與MG和EAMG的發(fā)病[28]。在不同的Th細(xì)胞亞型中，Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、TNF-β，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10，激活和維持體液免疫應(yīng)答。Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17、IL-18、IL-21、IL-22，在自身免疫性疾病的開始和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[29]，Treg細(xì)胞通過抑制自體活性細(xì)胞的激活和增殖來調(diào)節(jié)Th和B細(xì)胞的免疫反應(yīng)，因此對免疫平衡至關(guān)重要[30]。這四種Th細(xì)胞亞群的失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致MG和EAMG發(fā)病基本原因，而調(diào)節(jié)這些Th細(xì)胞亞群的分化及其分泌的細(xì)胞因子是治療這種自身免疫性疾病的一個(gè)中藥切入點(diǎn)，所以大部分中醫(yī)藥治療EAMG動(dòng)物模型的機(jī)制研究大多集中探討調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，糾正Th1/Th2/Th17/ Treg之間的免疫失衡。

B細(xì)胞有雙向調(diào)節(jié)作用，一些細(xì)胞因子如TGF-β、IL-10由B細(xì)胞分泌而來，TGF-β能抑制Th1、Th2細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子，IL-10可抑制CD4+T細(xì)胞向下分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)。CD19 是一種主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，有助于B細(xì)胞抗原受體識別特異性抗原并激活B淋巴細(xì)胞，在已知研究中CD19+B細(xì)胞亞群可促進(jìn)MG的發(fā)生發(fā)展[31]?，F(xiàn)有的大部分中醫(yī)藥干預(yù)EAMG模型動(dòng)物的研究大都局限在CD4+T淋巴細(xì)胞亞群分化平衡及細(xì)胞因子分泌抑制和促進(jìn)上，僅有1項(xiàng)研究[15]在探討中醫(yī)藥干預(yù)B淋巴細(xì)胞分化改善EAMG。MG是由自身抗原特異性B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體引起的[32]。B細(xì)胞可呈遞抗原，并分泌免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，從而在抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)出深刻的免疫抑制能力[33]。B細(xì)胞和漿細(xì)胞還可以通過產(chǎn)生細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β或IL-35來抑制自身免疫性炎癥[34]。誘導(dǎo)免疫抑制B細(xì)胞的分化可能是未來治療MG的一個(gè)方向。

中醫(yī)治療重癥肌無力一直遵循“治痿獨(dú)取陽明”原則，脾弱則肉虛，脾是后天養(yǎng)護(hù)之根本，故現(xiàn)代醫(yī)家皆從補(bǔ)脾，益脾，健脾為基本進(jìn)行立法處方。依據(jù)“脾胃為氣血生化之源”生理特點(diǎn)，有研究者從改善肌肉超微結(jié)構(gòu)角度上闡述其治療EAMG的作用機(jī)制，現(xiàn)代生物學(xué)上線粒體是能量代謝的始動(dòng)環(huán)節(jié)，故從增加線粒體產(chǎn)生上研究中醫(yī)藥治療EAMG的作用機(jī)制?！熬€粒體—脾”相關(guān)學(xué)說更貼近于中醫(yī)基本理論源流，很好的將分子生物學(xué)機(jī)制與中醫(yī)基礎(chǔ)理論結(jié)合在一起闡述MG的發(fā)生發(fā)展及治療靶向。

綜上，大多中醫(yī)藥治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力機(jī)制研究皆從調(diào)整免疫細(xì)胞分化平衡上立足，尤以改善Th1/Th2/Th17/Treg之間平衡最多，或在B細(xì)胞活化機(jī)制上，控制B細(xì)胞激活和增殖分化上進(jìn)行機(jī)制研究。如何將中醫(yī)特色理論充分地結(jié)合到分子生物學(xué)上闡述研究機(jī)制，將是我們中醫(yī)學(xué)者思考和研究的方向。