張 帆，趙 敏，李來酉，鹿曉菲，王 炎，張 銳

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.河北科技師范學院生命科技學院，河北 秦皇島 066004；3.哈爾濱工業(yè)大學基礎與交叉科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150001)

雙歧桿菌凍干菌粉制備工藝的研究

張 帆1,2，趙 敏1,*，李來酉1，鹿曉菲1，王 炎3，張 銳2

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.河北科技師范學院生命科技學院，河北 秦皇島 066004；3.哈爾濱工業(yè)大學基礎與交叉科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150001)

優(yōu)化雙歧桿菌凍干菌粉的制備工藝及檢測凍干菌粉在模擬人體胃腸環(huán)境中的耐受性和貯存穩(wěn)定性，采用3種方法制備雙歧桿菌凍干菌粉。方法1：雙歧桿菌在牛奶還原培養(yǎng)基中的擴大培養(yǎng)液加入甘露醇作為保護劑制備凍干菌粉；方法2：雙歧桿菌在PTYG培養(yǎng)基中的擴大培養(yǎng)液經低溫離心得到菌泥，向菌泥中加入保護劑甘露醇、增量賦形劑脫脂乳粉制備凍干菌粉；方法3：同方法2得到菌泥，向其中加入保護劑甘露醇、包埋劑明膠及增量賦形劑脫脂乳粉制備凍干菌粉。由方法2得到菌粉活菌數較高，為1.31×1010CFU/g；經模擬胃腸環(huán)境處理后，活菌數仍保持在4.19×108CFU/g；對胃酸、膽汁酸具有很高的耐受力。經典加速實驗證明由方法2制備的菌粉室溫保存1年以上活菌數仍保持在107數量級，具有較好的貯存穩(wěn)定性。

雙歧桿菌；菌泥；凍干保護劑；凍干菌粉；活菌數

Abstract ：This study investigated the preparation of lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum and assayed its tolerance to simulated human gastrointestinal environment and stability during storage at 37 ℃. Three methods used to prepare lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum were described as follows: Method 1: B. bifidum strain was amplified by culturing in reconstituted milk based medium and mannitol was then added as cryoprotectant to prepare lyophilized powder; Method 2:B. bifidum strain was amplified by culturing in PTYG medium and a bacterial mud was then obtained after hypothermal centrifugation. Finally, mannitol as cryoprotectant was added to the bacterial mud to prepare lyophilized powder; Method 3: A bacterial mud obtained as described in Method 2 was added with mannitol as cryoprotectant, gelatin as embedding medium, skim milk powder as excipient to prepare lyophilized powder. The results indicated that a higher viable count was observed in the lyophilized powder prepared by Method 2, which was up to 1.31 × 1010CFU/g and although exposed to simulated gastrointestinal environment, the lyophilized powder exhibited a viable count of up to 4.19 × 108CFU/g, which suggests that the lyophilized powder has excellent tolerance to gastric acid and bile acid. The classic accelerated experiment proved that the lyophilized power obtained Method 2 had good stability during storage at 37 ℃ and the viable count still kept at a magnitude of 107after storage for up to one year.

Key words：Bifidobacterium bifidum；bacterial mud；cryoprotectant；lyophilized powder；viable count of B. bifidum中圖分類號：TS201.1 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(2010)15-0221-04

雙岐桿菌(Bifidobacterium)是人體腸道中最重要的生理性細菌，發(fā)揮著生物屏障、營養(yǎng)、免疫、抗腫瘤及改善人體代謝等多種生理作用，被廣泛應用于醫(yī)療、保健及食品等領域[1]。但雙歧桿菌對氧氣極為敏感，對低pH值的抵抗力差[2]。液態(tài)雙歧桿菌制劑的活菌保藏期很短，4℃冷藏也只有5～7d[3-4]。雙歧桿菌制品普遍存在著貯存過程中活菌數量衰減快，服用時受胃酸、膽汁酸影響而導致到達腸道活菌數低的問題。目前多采用冷凍干燥、微膠囊及涂膜技術解決雙歧桿菌活菌數快速衰減問題[5]。

雙歧桿菌凍干菌粉可以抵抗一定的氧分壓，保藏期可達1～6個月[6-7]。過去對雙歧桿菌凍干菌粉研究，多集中于雙歧桿菌培養(yǎng)階段的研究[8]及菌粉制備方法的開發(fā)[9]，而雙歧桿菌凍干菌粉貯存特性及其在模擬人體胃腸整體環(huán)境中的特性是凍干菌粉在人體胃腸發(fā)揮功效的關鍵，關于雙歧桿菌凍干菌粉制備、菌粉特性及其在模擬人體消化環(huán)境方面的系統研究并未見報道。

本實驗系統研究雙歧桿菌的培養(yǎng)、凍干菌粉的制備方法，評價制備的凍干菌粉耐胃酸和耐膽汁酸特性、腸溶性及貯存穩(wěn)定性，確定制備雙歧桿菌凍干菌粉的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)1.1825(簡稱雙歧桿菌)來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，凍干保藏。

PTYG[10]改良培養(yǎng)基：用于雙歧桿菌活化及其計數。

人工模擬胃液配制：鹽酸16.4mL，胃蛋白酶(3800U/mg)10g，加水搖勻后定容至1000mL，pH1.2。人工模擬腸液配制：磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL溶解，用4g/L氫氧化鈉溶液調pH6.8；另取胰蛋白酶(2500U/mg)10g加水適量使其溶解，將兩液混合后，加水定容至1000mL[11]。人工模擬膽汁溶液的配制[12]：7號膽鹽(膽鹽含量＞65%)溶于水中，質量濃度為10g/L。

1.2 儀器與設備

YQX-1X型厭養(yǎng)培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；LYO-8.7真空冷凍干燥機 上海東富龍科技有限公司；BIOTECH-B-200厭氧發(fā)酵罐 保興生物設備工程有限公司；MLS-3020高壓滅菌鍋、超低溫冰箱 日本Sanyo電器集團；YMQ-MD-4.3滅菌器 哈藥股份有限公司宏偉醫(yī)療器械廠；DL-CJ-2N高性能無菌實驗臺 哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雙歧桿菌培養(yǎng)及活菌計數

采用PTYG改良培養(yǎng)基及牛奶還原培養(yǎng)基進行雙歧桿菌培養(yǎng)；按東北林業(yè)大學微生物及免疫學實驗室發(fā)明的雙歧桿菌雙層平板計數法進行計數[13]：待測的雙歧桿菌培養(yǎng)液稀釋為原菌濃度的10-6～10-7倍，將稀釋好的菌液1mL加入到滅菌培養(yǎng)皿中；把加熱融化后溫度降至40～50℃的PTYG培養(yǎng)基快速倒入培養(yǎng)皿中，用量為10～20mL/平皿，混勻，鋪成平板；培養(yǎng)基凝固后，再倒入以隔離氧氣為目的保護性覆蓋物(溶化后的PTYG固體培養(yǎng)基)，用量為10～20mL/平皿，鋪平，靜止片刻，待上層培養(yǎng)基凝固，培養(yǎng)24h后開始計數。

1.3.2 雙歧桿菌凍干菌粉凍干保護劑的篩選

采用真空冷凍干燥技術制備雙歧桿菌凍干菌粉，由于凍干中預凍過程對菌體傷害大，加入保護劑對保證活菌數十分重要。選用甘油、葡萄糖、明膠、甘露醇4種凍干保護劑進行實驗研究，其添加質量濃度均為50g/L，研究其保護效果。對照為雙歧桿菌培養(yǎng)液不加入保護劑，預凍后直接進行真空冷凍干燥。

由于雙歧桿菌活菌凍干前后物理狀態(tài)不同，所以采用樣品凍干后的活菌率來比較凍干過程中保護劑對菌體的保護能力。

1.3.3 雙歧桿菌凍干菌粉制備工藝

在預實驗基礎上，本實驗優(yōu)化獲得的3種制備雙歧桿菌凍干菌粉工藝，制備雙歧桿菌凍干菌粉。參考文獻[14]中雙歧桿菌生長曲線研究數據，雙歧桿菌接種到PTYG改良液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)32h進入對數生長期，接種到牛奶還原培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h進入對數生長期。

方法1：保藏的雙歧桿菌菌種(液體)按照體積比1:10的接種量接種到PTYG改良液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基上再加入已滅菌的液體石蠟，用以隔絕氧氣，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，37℃培養(yǎng)32h；取活化后的培養(yǎng)液接種到牛奶還原培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，接種量為1:10，37℃恒溫培養(yǎng)24h；將擴大培養(yǎng)液，加入50g/L甘露醇作為保護劑，－40℃預凍1h，放入真空冷凍干燥機中進行冷凍干燥[15]20h，得到1號菌粉。

方法2：菌種活化培養(yǎng)同方法1。取活化后的培養(yǎng)液接種到PTYG改良液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，接種量為1:10，37℃恒溫培養(yǎng)32h。取擴大培養(yǎng)液加入無菌離心管中，4℃、7000r/min離心10min收集菌體(菌泥)，無菌操作倒出上清液，向離心管中加入保護劑50g/L的甘露醇溶液、增量賦形劑100g/L的脫脂乳粉溶液[16]，混勻，分裝，真空冷凍干燥(同方法1)，得到2號菌粉。

方法3：菌種活化培養(yǎng)同方法1。取活化后的培養(yǎng)液接種到PTYG改良液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，接種量為1:10，37℃恒溫培養(yǎng)32h。取擴大培養(yǎng)液加入無菌離心管中，4℃、7000r/min離心10min收集菌體(菌泥)，無菌操作倒出上清液，向離心管中加入保護劑50g/L的甘露醇溶液、包埋劑50g/L的明膠溶液[17]及增量賦形劑100g/L的脫脂乳粉溶液，混勻，分裝，真空冷凍干燥(同方法1)，得到3號菌粉。

1.3.4 凍干菌粉的特性研究

準確稱取0.5g凍干菌粉分別溶于50mL人工胃液、50mL人工腸液及20mL人工膽汁溶液中，37℃、175r/min空氣搖床中進行研究：1)凍干菌粉溶于人工胃液中混合2h后活菌計數；2)凍干菌粉溶于人工膽汁溶液中30min后進行活菌計數；3)凍干菌粉溶于人工模腸液中45min后進行活菌計數；4)在模擬人體胃腸整體環(huán)境中的特性，凍干菌粉分別經人工胃液處理1h、人工膽汁溶液中處理30min、人工腸液中處理45min后，進行活菌計數。

保質期檢測：根據經典恒溫法的理論依據Arrhenius指數定律，雙歧桿菌凍干菌粉在恒溫37℃、相對濕度(RH)60%～65%條件下貯藏3個月，測其活菌數，此活菌數相當于室溫下貯藏1年以上雙歧桿菌衰減后的活菌數[18]。

2 結果與分析

2.1 菌種活化與凍干保護劑的篩選

2.1.1 雙歧桿菌活化培養(yǎng)后菌體的形態(tài)

培養(yǎng)的雙歧桿菌呈桿狀，有的有分支呈Y狀，為典型的雙歧桿菌生長形態(tài)。

2.1.2 凍干保護劑的篩選

表1 雙歧桿菌凍干菌粉制備的凍干保護劑篩選Table 1 Screening of cryoprotectants for lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum

從表1可以看出，4種保護劑在凍干過程中對雙歧桿菌都具有保護作用，不加保護劑時，凍干的活菌率只有2.62%。加入保護劑后，活菌率明顯提高。甘油和葡萄糖分別為27.86%和35%，明膠和甘露醇分別為64.18%和88.34%，說明甘露醇和明膠比較適合作為雙歧桿菌真空冷凍干燥過程中的保護劑。所以后續(xù)的研究主要選取甘露醇作為保護劑。

2.2 預凍溫度及預凍時間的研究

本實驗雙歧桿菌菌液應用真空冷凍干燥機進行凍干，基于凍干室容積，凍干裝液容器采用無菌青霉素瓶，裝液量均為10mL。選取50g/L甘露醇作為保護劑，預凍前凍干裝液容器中總活菌數為6.53×1010CFU。分別將雙歧桿菌菌液放入－20、－40、－80℃冰箱中進行預凍，時間分別為30、60、90、120min。

表2 預凍溫度及預凍時間對活菌數的影響Table 2 Effect of pre-freezing temperature and time on the viable count of Bifidobacterium bifidum CFU

由表2可知，雙歧桿菌菌液預凍過程中，在－20℃與－40℃條件下預凍30min活菌數同預凍前相比下降較少，但預凍狀態(tài)不佳，菌液中心呈黏液狀，不利于后續(xù)真空冷凍干燥。雙歧桿菌菌液在溫度為－40℃條件下預凍60min活菌數下降較少，且菌液預凍物理狀態(tài)良好。雙歧桿菌菌液在溫度－80℃預凍30min預凍完全，預凍速度快，活菌數下降較多。因此，雙歧桿菌真空冷凍干燥過程中，預凍溫度選用－40℃，時間為60min。

2.3 雙歧桿菌凍干菌粉特性

2.3.1 雙歧桿菌培養(yǎng)及制備凍干菌粉

分別對雙歧桿菌凍干菌粉制備方法1～3各工藝的各環(huán)節(jié)進行活菌計數。方法2、方法3雙歧桿菌擴大培養(yǎng)液離心收集的菌泥，也進行活菌計數。結果見表3。

表3 菌種活化與培養(yǎng)后活菌數量變化Table 3 Change in viable count of Bifidobacterium bifidum after strain activation and culture

從表3可以看出，雙歧桿菌保藏菌種活化后活菌數有很大提高。方法2、方法3制備凍干菌粉過程均采用低溫離心，得到的菌泥活菌數高達1010CFU/g。其中制得的2號菌粉活菌數也達到了1010CFU/g。

2.3.2 凍干菌粉在模擬人體胃腸整體環(huán)境中的性質比較

雙歧桿菌凍干菌粉要在人體腸道中發(fā)揮重要益生作用，故檢測了3種方法制備的凍干菌粉在模擬人體胃腸整體環(huán)境中的變化。根據1.3.4節(jié)的方法，分別對3種凍干菌粉耐胃酸、耐膽汁酸及腸溶性進行研究，并對3種菌粉經歷模擬人體胃腸整體環(huán)境后到達腸道的活菌數進行檢測，同時通過經典加速實驗檢測3種菌粉保存室溫貯存1年活菌數的變化，結果見表4。

表4 3種工藝制備的菌粉的特性Table 4 Characteristics of lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum prepared by three technological methods

從表4可以看出，1號菌粉抵抗膽汁酸的能力較強；2號菌粉抵抗胃酸的能力較強，腸溶效果較好；3號菌粉腸溶效果較差，可能是加入明膠后導致腸溶能力不佳。經過模擬人體胃腸整體環(huán)境后，活菌數最高的為2號菌粉，仍達到4.19×108CFU/g。

1、2號菌粉單獨經腸液處理45min后，其活菌數有較大幅度提高?？赡苁悄c液中含有促進雙歧桿菌生長的物質或pH值適合雙歧桿菌生長，雙歧桿菌通過繁殖增加了數量；3號菌粉明膠使菌體間黏連，導致計數偏低，腸液促進雙歧桿菌增殖現象不明顯。由此可解釋凍干菌粉經模擬人體胃腸整體環(huán)境后的活菌數，低于單獨人工腸液處理卻高于單獨人工胃液、人工膽汁溶液處理后的活菌數這一現象。

恒溫37℃、RH 60%～65%條件下貯存3個月，測定3種菌粉的活菌數，都達到106CFU/g，這相當于室溫條件下儲存一年后的活菌數。

3 討 論

3.1 雙歧桿菌擴大培養(yǎng)階段活菌數達到了7.38×109CFU/mL，比文獻[8]報道108CFU/mL高1個數量級。為獲得高密度雙歧桿菌菌懸液，采用離心擴大培養(yǎng)液的方法得到雙歧桿菌活菌數為2.76×1010CFU/g菌泥，比文獻[8]報道采用菌液超濾濃縮獲得相同數量級高密度菌懸液的方法更加簡便易行。

3.2 采用甘露醇作為真空冷凍干燥保護劑，菌粉存活率可達88.34%，相比于姚衛(wèi)蓉等[19]采用噴霧干燥的方法制備菌粉，菌體存活率為2.3%，袁亞宏等[20]采用真空冷凍干燥方法，菌粉存活率為70%，活菌率相對較高，穩(wěn)定性較好。

3.3 本研究中由方法2所制備的2號凍干菌粉活菌數達到1.31×1010CFU/g，依據此工藝制備的雙歧桿菌凍干菌粉同相關文獻[21]其他方法相比較，活菌數相對較高。在胃腸環(huán)境中活菌數穩(wěn)定，經過模擬人體胃腸環(huán)境后，活菌數仍可達到4.19×108CFU/g；經典加速實驗證明2號菌粉室溫保存1年以上活菌數仍保持在107數量級，比文獻[17]報道的6.5×105CFU/g要高得多。制備的2號菌粉活菌數高，穩(wěn)定性較好，確定為3種方法中制備雙歧桿菌凍干菌粉的最佳工藝。

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Preparation of Lyophilized Bifidobacterium bifidum Powder

ZHANG Fan1,2，ZHAO Min1,*，LI Lai-you1，LU Xiao-fei1，WANG Yan3，ZHANG Rui2
(1. College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Life Science and Technology Institute, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, China；3. Academy of Fundamental and Interdisciplinary Sciences, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China)

2009-12-17

哈爾濱市科技攻關項目(0114211066)；大慶市科技局產業(yè)化項目(SCYH2006-007)

張帆(1983—)，女，助教，碩士研究生，研究方向為微生物制藥。E-mail：hljszf@163.com

*通信作者：趙敏(1964—)，男，教授，博士，研究方向為生物制藥。E-mail：82191513@163.com