王玉蓉，鄒海艷，2，周洪偉，肖堯，馬勁

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102;2.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069)

口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)(oral colon－specific drug delivery system;OCDDS)，是指采用適當?shù)姆椒?，使藥物?jīng)口服后避免在胃、十二指腸、空腸和回腸前端釋放，運送至回盲部后發(fā)揮局部或全身治療作用的一種新型給藥系統(tǒng)。由于結(jié)腸的結(jié)構(gòu)和生理特點，OCDDS具有獨特的優(yōu)勢，成為近年來新型給藥系統(tǒng)的研究熱點之一。

OCDDS按照釋藥機理可以分為:pH依賴型、時間依賴型、壓力控制型、菌群觸發(fā)型等［1］。由于人體胃腸道環(huán)境復雜，影響因素較多，因此，在實際研究工作中，常將兩種或兩種以上的機制聯(lián)合應用，以達到滿意的結(jié)腸定位效果。本課題采用pH－時滯和pH－酶觸兩種釋藥模式，以鹽酸小檗堿和木香提取物為研究對象，對復方小檗堿結(jié)腸定位片的制備工藝和體內(nèi)外評價方法進行了研究，有關(guān)制備工藝研究已發(fā)表了相關(guān)論文［2，3］。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DP單沖壓片機(北京國藥龍立科技公司);島津SPD－10Avp高效液相色譜儀;紫外檢測器(日本島津公司);萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);ZRS－8型智能藥物溶出度實驗儀(天津無線電廠);pHS－3C精密酸度計(上海偉業(yè)儀器廠);BY－300A型小型包衣機(上海黃海藥檢儀器有限公司);KQ－100DB醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿原料(四川省什邡鴻運生物化工有限公司);木香提取物(西安奧晶科技發(fā)展有限公司);鹽酸小檗堿對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號 0713－200107);Eudragit S100、Eudragit L100、PVP K30(德國BASF公司);乙基纖維素水分散體(Surelease，固含物占25%(w/w)，上?？房蛋掠邢薰?;聚乙二醇6000(PEG 6000，北京市海淀會友精細化工廠);果膠(富達果膠工業(yè)有限公司);瓜耳豆膠(北京鳳禮精求商貿(mào)有限責任公司進口封裝);果膠酶Pectinase、β－甘露聚糖酶Beta－Mannanase(北京博仕奧生物技術(shù)有限公司)、微晶纖維素(MCC，湖州展望藥業(yè)有限公司);羧甲基淀粉鈉(CMS－Na，營口奧達制藥有限公司)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific);水(超純水);其余試劑均為分析純。

1.3 動物 Wistar大鼠50只，雌雄兼用，體重200～250g(合格證號 SCXK(京)2006－0009，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 復方小檗堿結(jié)腸定位包衣片的輔料篩選

2.1.1 時滯層包衣料的篩選

在Surelease中加入占固含物量10%的PVP，調(diào)節(jié)時滯層衣膜的水滲透性?？刂颇c溶聚合物增重為4%，使時滯層增重分別為4%、5%、6%，考察時滯層包衣厚度對釋藥速度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同厚度時滯層對包衣片釋放度的影響

由圖1可示，當時滯層增重6%(腸溶衣料增重4%)時包衣片在人工腸液中的釋藥時滯為174～207min，與藥物進入小腸末端或升結(jié)腸的時間基本相符。

2.1.2 pH－依賴層包衣料的篩選

2.1.2.1 腸溶衣料不同比例對釋藥速度的影響

采用丙烯酸樹脂Eudragit L10和Eudragit S100為腸溶材料，將二者按一定比例混合，調(diào)節(jié)衣膜溶解速度，以達到預期釋藥效果。將Eudragit L100和 Eudragit S100按1:1、1:2、1:4比例，分別配制包衣液，包衣增重為3.7%，進行釋放度試驗，結(jié)果見圖2。當Eudragit L10與Eudragit S100的比例為1:2時，鹽酸小檗堿在進入小腸后0.5h開始快速溶出，符合本實驗的設計要求。

圖2 Eudragit L與Eudragit S不同比例對釋放度的影響

2.1.2.2 增塑劑種類對釋藥速度的影響

觀察TEC、PEG6000和DEP三種增塑劑對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖3。其中以PEG 6000為增塑劑時釋藥速率最快，故本研究選用PEG6000為增塑劑，用量為聚合物的20%(W/W)。

圖3 不同種類增塑劑對釋放度的影響

2.1.3 酶觸材料的篩選

2.1.3.1 酶觸材料種類的篩選

考察果膠、瓜耳豆膠及果膠與瓜耳豆膠比例1:1制成的鹽酸小檗堿片溶出情況，以小腸模擬介質(zhì)2h突釋量(%)和結(jié)腸模擬介質(zhì)6h釋放量(%)的topsis綜合值為指標，篩選酶觸材料的種類。結(jié)果見表1。

體外釋藥的結(jié)果表明:由果膠和瓜耳豆膠以1∶1比例制得的鹽酸小檗堿片，突釋現(xiàn)象較輕，能控制藥物使其緩慢釋放。

表1 酶觸材料的種類對釋藥情況的影響

2.1.3.2 酶觸材料比例的篩選

考察果膠和瓜耳豆膠比例為1∶1.5、1∶1、1.5∶1的鹽酸小檗堿片溶出情況，篩選酶觸材料的比例。以小腸模擬介質(zhì)2h突釋量和結(jié)腸模擬介質(zhì)6h釋放量(%)的topsis綜合值為指標，結(jié)果如圖4。

圖4 果膠與瓜爾豆膠不同比例對釋放的影響

結(jié)果表明:按不同比例制得的復合膠片，果膠用量越大，對小檗堿的控釋效果越差，當瓜耳豆膠用量上升到果膠用量的1.5倍時，控釋效果與1倍量無明顯差異。確定果膠和瓜耳豆膠比例為1∶1。

2.2 結(jié)腸定位包衣片的制備

2.2.1 pH－時滯型包衣片的制備

將鹽酸小檗堿、木香提取物及輔料按處方混合均勻，制粒并壓制6mm片芯。所得片芯由內(nèi)到外依次包上時滯層(增重6%)和腸溶層(增重4%)。

時滯層:量取適量Surelease包衣液，加入蒸餾水使成固含量15%，繼續(xù)攪拌15min，即得時滯層包衣液。將片芯置包衣鍋中，在滾動下噴入包衣液。包衣條件:包衣鍋傾角45°;通入噴槍壓縮空氣壓力為0.2～0.4MPa;噴槍口徑為 1mm;轉(zhuǎn)速 40r·min－1;熱風溫度保持在50℃。

腸溶層:按比例稱取包衣料制成5%乙醇溶液，加入適量增塑劑，攪勻，即得。包衣方法與條件:除熱風溫度為38℃外，其他同“時滯層”項下。制得pH－時滯型包衣片。

2.2.2 pH－酶觸包衣片的制備

片芯的制備:稱取處方量鹽酸小檗堿、木香提取物、適量酶觸材料。依照等量遞加法混合均勻后過60目篩，以85%乙醇為粘合劑，濕法制粒，干燥，整粒，加入0.5%硬脂酸鎂，混勻，單沖壓片機壓制6mm片，片重0.1g，硬度4 ～5kg。

腸溶層包衣同上。

2.3 體外釋放度試驗

2.3.1 pH－時滯型復方片

按《中國藥典》(2005版二部)附錄XC溶出度測定第二法，將包衣片置于900mL溶出介質(zhì)中，轉(zhuǎn)速100r·min－1，溫度(37 ±0.5)℃，模擬包衣片在胃腸道中的釋放行為，釋放介質(zhì)分別為0.1mol·L－1HCl(0～2h)、pH6.8 PBS(2～5h)和pH7.6 PBS(5h～結(jié)束)，每次取樣2mL(同時補加同溫同體積介質(zhì) 2mL)，用0.45μm微孔濾膜濾過，進樣10μL，HPLC法測定，以鹽酸小檗堿含量為指標，計算包衣片的累積釋放度，并且繪制包衣片的累積釋放曲線，評估藥片的體外釋藥性能。結(jié)果表明，該片劑在模擬胃液中不釋放，在pH6.8 PBS中累積釋放10%的時間t0.1為(199.6±14.7)min，與進入回盲部的時間基本相符，基本達到了結(jié)腸定位制劑的體外釋藥要求(圖5)。

圖5 pH－時滯型復方片的體外累積釋放曲線

2.3.2 pH－酶觸型復方片

按《中國藥典》2005版(二部)附錄XC溶出度測定第二法，釋放介質(zhì)選擇0.1mol·L－1HCl溶液為人工胃液(0～2h)，pH6.8 PBS為人工小腸液(2～5h)和pH5.8 PBS人工結(jié)腸液(含果膠酶 0.5g·L－1，β － 甘露聚糖酶0.5g·L－1;5～11h)。測定方法同上。

將包衣骨架片2～11h的溶出數(shù)據(jù)進行零級方程，一級方程，Higuchi方程擬合。結(jié)果見表2。

表2 包衣骨架片釋藥模型擬合

結(jié)果表明:包衣骨架片在加酶介質(zhì)中從2～11h的釋放狀態(tài)基本符合零級方程。

2.4 HPLC含量測定方法

2.4.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm);流動相:乙腈 －0.05M KH2PO4(H3PO4調(diào) pH 3.0)(60∶40)，流速 1.0mL·min－1，檢測波長345nm。

2.4.2 標準曲線 取鹽酸小檗堿對照品5mg，精密稱定，用蒸餾水稀釋定容于25mL容量瓶中，作為濃儲備液。精密量取儲備液適量，加蒸餾水稀釋成濃度分別為 2.07、4.14、8.28、20.70、41.40μg·mL－1的標準溶液，進樣10μL，于345nm處測定峰面積。以峰面積(A)對進樣量(x)進行回歸，得標準曲線方程:A=3551340.17x+37796.15，r=0.9995。表明鹽酸小檗堿進樣量在0.0207～0.414μg內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 方法學考察(略)

2.5 體內(nèi)定位釋藥評價研究

2.5.1 復方小檗堿結(jié)腸定位小片的制備 按上述工藝分別制備了pH－時滯和pH－酶觸復方小檗堿結(jié)腸定位小片(Φ3mm)，調(diào)整了包衣增重，體外釋放度試驗符合相關(guān)要求。

2.5.2 動物實驗方法 將自制的結(jié)腸定位片(Φ3mm)分別經(jīng)特制的灌胃器給大鼠灌胃，以考察藥物在大鼠胃腸道中的釋藥情況。每組大鼠25只，雌雄兼用。大鼠給藥前禁食24h，給藥前30min禁水。每組大鼠再隨機分為5組，每組5只，灌胃給藥，每只大鼠給藥1片。分別于給藥后2、4、5、6、8h處死，分取胃腸道(胃、小腸近端、小腸遠端、盲腸、結(jié)腸)，用人工胃腸液少量多次沖洗其內(nèi)容物，并定容至50mL后超聲10min，4000 r·min－1離心 15min，精密吸取胃腸道內(nèi)容物上清液0.3 mL，加入3倍量甲醇，渦旋混勻，6000r·min－1離心 5min，取上清液用 0.45μm 微孔濾膜濾過，HPLC測定，進樣10μL。將各腸道內(nèi)鹽酸小檗堿分布量進行平均處理，結(jié)果分別見表3和表4。

表3 pH－時滯型復方小檗堿片在大鼠胃腸道內(nèi)的分布情況(±s，n=3)

表3 pH－時滯型復方小檗堿片在大鼠胃腸道內(nèi)的分布情況(±s，n=3)

T(h)胃(mg)小腸近端(mg)小腸遠端(mg)盲腸(mg) 結(jié)腸(mg)2 － － 0.10±0.00 － －4 － － 2.38±0.08 － －5 － － 1.54±0.82 1.56±0.83 －6 － － 0.33±0.35 1.53±0.83 －8 － － － 1.40±0.83 0.37±0.51均值 － －1.231.490.37

表4 pH－酶觸型復方小檗堿片在大鼠胃腸道內(nèi)的分布情況(±s，n=3)

表4 pH－酶觸型復方小檗堿片在大鼠胃腸道內(nèi)的分布情況(±s，n=3)

T(h)胃(mg)小腸近端(mg)小腸遠端(mg)盲腸(mg) 結(jié)腸(mg)2 － － 0.44±0.24 － －4 － － 0.77±0.6 0.31±0 －5 － － 0.73±0.26 0.90±0.73 －6 － － 0.27±0.25 1.53±1.71 －8 － － 0.08±0 0.72±0.46 2.18±2.78均值 － －0.460.872.18

結(jié)果表明，兩種類型的復方小檗堿結(jié)腸定位片在胃及小腸前端均不釋藥，當藥片推進到小腸遠端時，開始釋放藥物，在盲腸及結(jié)腸處大量釋放鹽酸小檗堿。

3 討論

3.1 關(guān)于時滯層輔料的選擇 pH－時滯型釋藥模式的設計基于pH依賴與時間雙重控制原理，基本思路為將片芯由內(nèi)到外依次包上時滯層和腸溶衣層。Aquacoat和Surelease包衣料是目前上市的兩個乙基纖維素(EC)水分散體品種，常用于緩控釋制劑的包衣。Surelease在包衣過程就可以實現(xiàn)膜愈合完全，不需要包衣后再進行熱處理，而Aquacoat在包衣結(jié)束后還需經(jīng)過一段時間的熱處理，才能使膜愈合完全。因此本實驗選擇Surelease為時滯層包衣料。

3.2 關(guān)于酶觸型輔料的選擇 目前用于菌群觸發(fā)型結(jié)腸定位給藥的輔料主要有兩大類:一類是合成的聚合物，另一類是天然多糖類。由于多糖類物質(zhì)易于化學和生物改性，具有價廉、來源廣泛、穩(wěn)定性高、安全、無毒以及易于形成凝膠等優(yōu)良特性，已成為很有發(fā)展?jié)摿Φ陌邢蛩幬飩鬟f系統(tǒng)載體［4］。本實驗混合使用了采用果膠和瓜尓豆膠混合膠，由于果膠的水溶性較高，單獨使用無法有效控制藥物在小腸的釋放;而瓜耳豆膠屬于黏度大的天然膠，能形成有效的凝膠層控制藥物釋放，但酶解速度較慢。當果膠與瓜耳豆膠以不同比例復合使用時，藥物釋放速率可達到相關(guān)要求。

3.2 關(guān)于動物的選擇 很多OCDDS的體內(nèi)研究選擇犬作動物模型，但犬的胃腸道生理特點與人體相差較大［5］，此外小檗堿在犬體內(nèi)吸收差，較大劑量有毒副作用［6］。大鼠是目前公認的與人體消化道的解剖結(jié)構(gòu)、生理特點、生化環(huán)境相似、廉價的動物，因此本實驗選擇大鼠進行體內(nèi)研究。

3.3 關(guān)于小片的制備 本實驗選擇與人體胃腸道特點較接近的大鼠為受試動物，為便于口服給藥，根據(jù)大片的制備原理和方法制備Ф3mm的小片，并制作了特制的動物灌胃器，對pH－時滯型結(jié)腸定位片的體內(nèi)釋藥行為進行了初步考察，同時也曾對pH－酶觸結(jié)腸定位片進行大鼠體內(nèi)定位的初步評價，也已表明兩種口服包衣片均在小腸遠端、盲腸和結(jié)腸部位釋藥，具有一定的適用性。為保證結(jié)腸定位小片與大片有相近的釋藥性能，本實驗以體外釋放試驗為基礎(chǔ)對小片的包衣增重進行了考察，由大片原工藝擬制小片的包衣增重規(guī)律還需進一步驗證，有關(guān)體內(nèi)的釋藥特性也有待進一步研究。

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