蔡勤仁,曾振靈,馮家望,彭玉芬,張 毅

(1.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東珠海 519015;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

LC-MS/MS法結(jié)合譜庫(kù)檢索測(cè)定豬組織中三聚氰胺及其同系物

蔡勤仁1,曾振靈2,馮家望1,彭玉芬1,張 毅1

(1.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東珠海 519015;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

采用MRM→IDA→EPI→譜庫(kù)檢索模式建立了豬組織中三聚氰胺及其同系物的液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜多殘留檢測(cè)方法,結(jié)合譜庫(kù)檢索功能同時(shí)實(shí)現(xiàn)了定性定量分析。組織樣品經(jīng)2%三氯乙酸、10%乙酸鉛和乙腈混合溶液提取,Sepucol ENVI-CARB柱凈化,三聚氰胺及其同系物的線性范圍為10～5 000 μg·kg-1,線性關(guān)系良好(r＞0.99);在10～100μg·kg-1添加水平范圍內(nèi),平均回收率為94.2%～99.9%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～7.5%、方法檢出限為2μg·kg-1。

三聚氰胺;豬組織;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS);譜庫(kù)

三聚氰胺有多種同系物,如三聚氰酸(cyanuric acid)、三聚氰酸一酰胺(ammelide)、三聚氰酸二酰胺(ammeline)和環(huán)丙氨嗪(cyromazine)等,其結(jié)構(gòu)式示于圖1。食品和藥物管理局(FDA)在引起寵物中毒的食品中檢出了以下三聚氰胺同系物:三聚氰胺 8.4%、三聚氰酸5.3%、三聚氰酸一酰胺2.3%、三聚氰酸二酰胺1.7%以及脲基三聚氰胺和甲基三聚氰胺等[1],這些同系物是導(dǎo)致寵物中毒的直接原因。目前,國(guó)內(nèi)外同時(shí)檢測(cè)三聚氰胺及其同系物的方法報(bào)道不多,美國(guó)FDA和我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)都是采用氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)奶粉中三聚氰胺及其同系物。Muiz-Valencia等[2]采用液相色譜測(cè)定了大米濃縮蛋白中的三聚氰胺及其3種同系物;欒偉[3]研究了寵物食品中三聚氰胺及三聚氰酸的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法;另有雞蛋、飼料、牛奶等基質(zhì)中同時(shí)檢測(cè)三聚氰胺及其同系物殘留方法的報(bào)道[4-8]。美國(guó)和我國(guó)政府都嚴(yán)禁在飼料或食品中添加三聚氰胺類物質(zhì),但三聚氰胺及其同系物在牛奶、雞蛋、雞肉、豬肉、魚等動(dòng)物源性食品中仍被檢出,因此建立一種同時(shí)測(cè)定這幾種結(jié)構(gòu)相似的三嗪類化合物多殘留方法非常必要。

本研究選擇三聚氰胺及其4種同系物為研究對(duì)象,建立相應(yīng)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜譜庫(kù),結(jié)合譜庫(kù)檢索建立豬組織中三聚氰胺及其同系物的LC-MS/MS多殘留檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀;API 4000 Q-Trap三重四極質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源;Agilent固相萃取儀;JOUAN MR23i離心機(jī);Zymark TurboVapLV濃縮站;恒溫水浴振蕩器等。

Sepucol ENVI-CARB(3 mL/60 mg);三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99%):德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品;三聚氰胺內(nèi)標(biāo) (melamine15N3)和三聚氰酸內(nèi)標(biāo) (cyanuric acid-13C3)(純度大于 98.0%):加拿大 Toronto research chemicals公司產(chǎn)品。上述標(biāo)準(zhǔn)品用少量二甲基亞砜溶解,甲醇(色譜純)定容,配制成1 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)工作液,于4℃下保存,乙酸銨、乙腈等均為色譜純;所用試劑除注明外均為分析純;水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱:Waters Atlantis HILIC(150 mm×2.1 mm×3μm);流動(dòng)相:5.0 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液(A)和乙腈(B),在0～2 min內(nèi)溶劑A體積含量為90%,在2～10 min內(nèi)溶劑A體積含量從90%線性減少到15%,然后保持5 min,在15～17 min內(nèi)溶劑A體積含量從15%線性增加到 90%,并平衡 8 min;進(jìn)樣量:20 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源:ESI;霧化氣65 mL·min-1,氣簾氣20 mL·min-1,輔助加熱氣70 L·min-1,輔助加熱氣溫度700℃,碰撞氣5 mL·min-1,以上4種氣體均為氮?dú)?Q1和Q3均為單位分辨率;ESI模式、去簇電壓(declustering potential,DP)、駐留時(shí)間(dwell time)和碰撞能(collision energy,CE)等質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

1.4 LC-MS/MS譜庫(kù)

分別用高、中、低3種碰撞能量對(duì)5種三聚氰胺類化合物進(jìn)行 EPI掃描,并用Access編寫三聚氰胺及其4種同系物液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2 g(精確到0.01 g)組織樣品,分別加入10μL 20 mg·L-1三聚氰胺內(nèi)標(biāo)和三聚氰酸內(nèi)標(biāo)溶液,12 mL 2%三氯乙酸,2 mL乙酸鉛和6 mL乙腈,勻漿30 s,超聲5 min,80 ℃加熱 20 min,以 5 000 r·min-1離心 5 min,取 10 mL上清液過(guò)Sepucol ENVI-CARB 3 mL小柱(小柱分別用3 mL二氯甲烷、甲醇、0.04%乙酸活化),再用3 mL水淋洗,抽干,最后用10 mL甲醇洗脫,收集洗脫液于45℃氮?dú)鉂饪s至近干,加入1.0 mL 70%乙腈(含0.1%甲酸)溶解殘?jiān)?渦旋振蕩器振蕩1 min,以15 000 r·min-1離心5 min,上清液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.6 檢測(cè)模式

MRM→IDA→EPI→譜庫(kù)檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法

5種三聚氰胺類化合物具有不同的p Ka值,因此在溶液中呈現(xiàn)不同的解離狀態(tài),要同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)5種三聚氰胺類化合物的提取,必須選擇合適的溶劑組合。本研究選擇三氯乙酸溶液、乙腈、乙酸鉛3種提取溶劑進(jìn)行組合,并研究了超聲和加熱等前處理方法對(duì)提取回收率的影響,最后確定12 mL 2%三氯乙酸、2 mL乙酸鉛和6 mL乙腈組合為最佳提取溶劑,當(dāng)樣品經(jīng)80℃加熱20 min時(shí)回收率明顯提高。通過(guò)比較MCX固相萃取柱和石墨碳黑柱的凈化效果,結(jié)果表明,Sepucol石墨碳黑柱對(duì)5種三聚氰胺類化合物的回收率都能滿足要求,MCX固相萃取柱對(duì)環(huán)丙氨嗪、三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的回收率最高,但對(duì)三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺幾乎無(wú)保留。

2.2 色譜條件的選擇

環(huán)丙氨嗪、三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺為強(qiáng)極性的小分子化合物,在C18鍵合相色譜柱中幾乎無(wú)保留。常見的解決方案是添加離子對(duì)試劑,形成反相離子對(duì)色譜[9]。一般來(lái)說(shuō),添加高離子強(qiáng)度的緩沖鹽和非揮發(fā)性的離子對(duì)試劑,不適用電噴霧離子源分析。另外,反相離子對(duì)色譜難以在一次運(yùn)行中同時(shí)分離酸性和堿性物質(zhì)。測(cè)定三聚氰胺常用磺酸基與C18混合填料色譜柱,這種填料色譜柱利用了陽(yáng)離子交換與反相保留的機(jī)理,增加了堿性化合物與極性化合物的保留,它對(duì)三聚氰胺類陽(yáng)離子化合物有很強(qiáng)的保留,但對(duì)三聚氰酸則不能保留。對(duì)于極性化合物而言,理想的解決方案是采用親水色譜(HILIC)。HILIC機(jī)理是極性的被分析物在相對(duì)非極性的流動(dòng)相和極性的固定相之間進(jìn)行分配[10]。正相色譜分離機(jī)理通常依靠固定相吸附被分析的物質(zhì),而在 HILIC色譜中,水被吸附在固定相的表面,主要依靠分配作用分離,而非吸附作用。在親水色譜系統(tǒng)中,有機(jī)溶劑為弱洗脫溶劑,增加其比例則保留時(shí)間變長(zhǎng);水溶液為強(qiáng)洗脫溶劑,增加其比例保留時(shí)間會(huì)變短。本研究比較了幾種 HILIC柱的分離效果,發(fā)現(xiàn)Waters Atlantis HILIC柱的分離效果最好。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用蠕動(dòng)泵以5μL·min-1的流速連續(xù)注射0.5 mg·L-1的5種三聚氰胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,在ESI模式下對(duì)以上5種化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析(Q1掃描),得到準(zhǔn)分子離子峰[M+1]和[M-1],對(duì)于兩性化合物三聚氰酸一酰胺與三聚氰酸二酰胺,為獲得最好的質(zhì)譜電離方式,分別于正負(fù)離子模式下掃描,結(jié)果表明,三聚氰酸二酰胺在正離子模式下[M+H]+響應(yīng)強(qiáng)度最高,三聚氰酸一酰胺在負(fù)離子模式下[M-H]-響應(yīng)強(qiáng)度最高。然后以分子離子峰為母離子進(jìn)行子離子掃描。三嗪類化合物的質(zhì)譜裂解由六元環(huán)的開環(huán)開始,重組的四元環(huán)發(fā)生C-N鍵斷裂,產(chǎn)生主要的碎片離子。選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的2對(duì)子離子為定性和定量離子,以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式優(yōu)化每種化合物的去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。由于同時(shí)需要對(duì)正負(fù)離子進(jìn)行掃描,因此需要做正負(fù)離子切換,如果正負(fù)離子切換時(shí)間太長(zhǎng),對(duì)待測(cè)物的靈敏度和峰形都有一定的影響,本研究通過(guò)對(duì)洗脫梯度的調(diào)節(jié),將正負(fù)兩組離子分開,且兩組離子的保留時(shí)間有一定間隔。負(fù)離子保留時(shí)間:三聚氰酸1.19 min,三聚氰酸一酰胺1.38 min;正離子保留時(shí)間:環(huán)丙氨嗪 5.94 min,三聚氰胺 6.37 min,三聚氰酸二酰胺6.52 min,示于圖2。

在0～3 min做 ESI-掃描,在 3～8 min做ESI+掃描,這樣就有效的將正負(fù)離子切換的損失降到最低。為了同時(shí)實(shí)現(xiàn)定量定性的要求,本研究采用 MRM→IDA→EPI→譜庫(kù)檢索的模式,利用 Q-Trap的線性離子阱功能,在 MRM獲得化合物的保留時(shí)間、峰高、峰面積、離子比率等信息的同時(shí),通過(guò) EPI掃描獲得1張二級(jí)質(zhì)譜圖,可用已經(jīng)建立好的譜庫(kù)進(jìn)行檢索,這對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)確認(rèn)有很大幫助,實(shí)際樣品檢測(cè)示譜圖于圖3～5。

圖2 三聚氰胺及其同系物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取離子圖(50μg·kg-1)Fig.2 Extracted product ion spectrum of melamine and its homologues(50μg·kg-1)

圖3 三聚氰胺陽(yáng)性樣品重構(gòu)離子色譜圖Fig.3 Reconstituted ion chromatogram of the doubtful positive sample

圖4 陽(yáng)性可疑樣品EPI掃描圖Fig.4 EPI mass sepctrum of the doubtful positive sample

圖5 陽(yáng)性可疑樣品譜庫(kù)檢索Fig.5 Results of search library for the doubtful positive sample

2.4 線性范圍、變異系數(shù)、回收率和檢測(cè)限

將三聚氰胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用空白組織提取液依次稀釋成10～5 000μg·L-1系列濃度,并加入 10μL三聚氰酸-13C3和三聚氰胺-15N3內(nèi)標(biāo)溶液,按1.5方法測(cè)定。將測(cè)得的各種三聚氰胺類藥物峰面積的平均值(X)與所對(duì)應(yīng)的藥物濃度(Y)做線性回歸,內(nèi)標(biāo)法定量,其中三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、三聚氰酸二酰胺用三聚氰胺-15N3校正,三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺用三聚氰酸-13C3校正,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。準(zhǔn)確取2 g(準(zhǔn)確至0.01 g)組織樣品 ,分別制得 10、50、100μg·kg-1添加水平樣品,并加入三聚氰酸-13C3和三聚氰胺-15N3內(nèi)標(biāo)溶液,內(nèi)標(biāo)濃度均為100μg·kg-1,按照上述方法處理和測(cè)定。每個(gè)濃度做5個(gè)重復(fù),共做4批,并計(jì)算回收率和變異系數(shù)。本方法三聚氰胺及其同系物的檢出限,線性范圍,回歸方程,回收率及相關(guān)系數(shù)列于表2。

3 結(jié) 論

建立了測(cè)定豬組織中三聚氰胺及其4種同系物的高效液相-電噴霧質(zhì)譜多殘留檢測(cè)方法,該方法采用MRM→IDA→EPI→譜庫(kù)檢索模式,能同時(shí)實(shí)現(xiàn)定量定性分析。方法在10～5 000μg·L-1濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,在10～100μg·kg-1添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為94.2%～99.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～7.5%,方法檢出限為2μg·kg-1。該方法的技術(shù)指標(biāo)滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)三聚氰胺及其4種同系物檢測(cè)的相關(guān)要求。

表2 方法的檢出限、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 2 The limits of detection,linearity,recovery and precision of the method

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Determination of Melamine and Its Homologues in Pig Tissues by LC-MS/MS Combining with Spectral Library Search

CAI Qin-ren1,ZENG Zhen-ling2,FENGJia-wang1,PENG Yu-fen1,ZHANG Yi1
(1.Zhuhai Entry&Exit Inspection and Quarantine B ureau,Zhuhai519015,China;2.College of Veterinary Medicine,South China A gricultural University,Guangzhou510642,China)

MRM→IDA→EPI→spectral library search model was used to establish a HPLC-electrospray ionization tandem mass spectrometry method for the multi-residue detection of melamine and its homologues in pig tissues.The quantitative and qualitative analysis of the target analytes were achieved by with spectral library search function.Tissue samples were treated with 2%trichloroacetic acid,10%lead acetate solution and acetonitrile for extraction,purified with Sepucol ENVI-CARB column.The analytical method in the present study was well validated,and good results were obtained with respect to precision,repeatability and spiked recovery.The limit of detection is 2μg·kg-1for melamine and its homologues,and with a linear range from 10 to 5 000μg·kg-1.The recoveries are between 94.2%and 99.9%,and RSDs are between 3.8%and 7.5%.

melamine;pig tissues;LC-MS/MS;spectral library

O 657.63

A

1004-2997(2010)05-277-06

2009-12-21;

2010-05-11

蔡勤仁(1974～),男,博士,高級(jí)工程師,從事食品安全研究。E-mail:mr.cai@vip.163.com