向 弘,朱 斌,王雪毓,劉 早,李曉璽,徐昕榮,陳 玲

(1.華南理工大學(xué)分析測試中心,廣東廣州 510640; 2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

HPLC-MS/MS法快速測定淀粉生物粘附材料特異性結(jié)合糖類物質(zhì)的含量

向 弘1,朱 斌1,王雪毓2,劉 早2,李曉璽2,徐昕榮1,陳 玲2

(1.華南理工大學(xué)分析測試中心,廣東廣州 510640; 2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

研究了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測定淀粉生物粘附材料與糖殘基特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺4種糖類物質(zhì)含量的分析方法。將反應(yīng)后的樣品直接離心過濾后即可利用HPLC-MS/MS進(jìn)行定性定量分析。以V(乙腈)∶V(水)=80∶20的溶液作為液相色譜流動(dòng)相,質(zhì)譜采用電噴霧負(fù)離子電離方式掃描,以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行定量分析。在添加水平為1.0～40.0 mg·L-1范圍內(nèi),巖藻糖的回收率為111.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.55%;在添加水平為1.0～80.0 mg·L-1范圍內(nèi),半乳糖、α-甲基甘露糖苷和N-乙酰葡萄糖胺的回收率分別為106.5%、99.0%和91.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.78%、6.64%和5.68%。4種糖類物質(zhì)的方法檢出限(S/N≥3)分別為0.1 mg·L-1(巖藻糖),1.0 mg·L-1(半乳糖),0.1 mg·L-1(α-甲基甘露糖苷)和0.5 mg·L-1(N-乙酰葡萄糖胺)。該方法可用于評價(jià)淀粉粘附材料和糖類物質(zhì)的特異性結(jié)合,為其他領(lǐng)域中糖類物質(zhì)含量的測定提供可借鑒的方法。

淀粉生物粘附材料;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS);糖類物質(zhì)

生物粘附(bioadhesion)是指天然或合成的高分子物質(zhì)所具有的能夠粘附到腔道粘液(mucus)或上皮細(xì)胞表面的能力[1]。在淀粉生物粘附材料中引入的糖蛋白側(cè)鏈能特異性識別細(xì)胞表面的糖殘基并與之結(jié)合,如 N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、果糖及唾液酸等,在細(xì)胞識別和粘附反應(yīng)中起著重要作用[2-3]。因此,通過測定淀粉粘附材料上的糖蛋白與糖類物質(zhì)特異性結(jié)合后剩余的糖量,計(jì)算得到能與粘附材料特異性結(jié)合的糖,從而可確定淀粉粘附材料與人體胃腸道上皮細(xì)胞特異粘附部位。

目前,測定糖類物質(zhì)含量的最常用方法有比色法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。比色法[4]易受到其他可與顯色試劑反應(yīng)的物質(zhì)的干擾;氣相色譜法須將樣品衍生化才能進(jìn)行分析[5];液相色譜法不需要衍生化,但是測定糖常用的示差折光檢測器靈敏度較低,需通過柱前衍生,然后用紫外和熒光檢測提高靈敏度,操作繁雜且常出現(xiàn)異常干擾,影響分析的準(zhǔn)確性[5]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)分析物質(zhì)具有靈敏度高,樣品一般不需衍生化處理的特點(diǎn)。目前國內(nèi)采用LC/MS法測定糖類物質(zhì)的報(bào)道中,主要是利用單級質(zhì)譜或多級質(zhì)譜法對糖類物質(zhì)做定性研究。徐瑾[6]使用柱前衍生法分別對蘆薈多糖樣品和其水解產(chǎn)物進(jìn)行衍生,結(jié)合LC/MS法檢測,以說明其“結(jié)構(gòu)單元”單糖的組成。孫志偉等[7]利用在線串聯(lián)質(zhì)譜的電噴霧電離模式監(jiān)測,獲得了油菜花粉多糖中各組分的質(zhì)譜定性規(guī)律。Cappiello等[8]利用親水作用色譜和電噴霧質(zhì)譜直接研究海洋粘膠中低聚糖的組成情況。Wan等[9]通過LC/MS法研究大氣氣溶膠中三糖以下糖類物質(zhì)的含量,以[M+NH4]+加合離子作為目標(biāo)物質(zhì)的定性定量離子。胡強(qiáng)等[10]建立了LC-MS/MS法測定人尿中乳果糖、甘露醇和乳糖含量,可用于腸通透性評價(jià)。而利用 HPLCMS/MS法直接進(jìn)行糖類物質(zhì)定量分析的報(bào)道較少。

用LC/MS法進(jìn)行定量分析時(shí),不采用總離子色譜圖,而是采用與待測組分相對應(yīng)的特征離子得到的質(zhì)量色譜圖或多離子監(jiān)測色譜圖。此時(shí),不相關(guān)的組分將不出峰,可以減少組份間的互相干擾。LC/MS定量的最好方法是采用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。MRM技術(shù)是基于已知信息或假定信息,設(shè)定質(zhì)譜檢測規(guī)則,對符合規(guī)則的離子進(jìn)行信號記錄,去除大量不符合規(guī)則的離子信號干擾,從而得到質(zhì)譜信息的一種數(shù)據(jù)獲取方式。具體地說,即是根據(jù)母離子質(zhì)量數(shù)和特征碎片離子質(zhì)量數(shù),選擇母離子/特征碎片離子對,允許符合設(shè)定的母離子進(jìn)入碰撞室,碰撞完成后,只記錄設(shè)定特征碎片離子信號。通過母離子和特征碎片離子的兩次選擇,去除干擾離子,降低化學(xué)背景,提高靈敏度[11]。

本工作選擇4種細(xì)胞表面含有的糖類物質(zhì),巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺,利用HPLC-MS/MS的MRM模式作為定量研究手段,直接測定未與淀粉粘附材料特異結(jié)合的剩余糖量,可用于評價(jià)淀粉生物粘附材料和細(xì)胞表面糖類物質(zhì)的特異性結(jié)合。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙腈(色譜純):德國Merk公司產(chǎn)品;水:超純水;巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)品:美國 Vector Laboratories公司產(chǎn)品。

Bruker Esquire HCT PLUS大容量離子阱質(zhì)譜儀:德國Bruker公司產(chǎn)品,配有電噴霧離子源(ESI);1100系列高效液相色譜儀:美國Agilent公司產(chǎn)品,配有四元泵、在線真空脫氣機(jī)、柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取一定體積的巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水分別配制成濃度為1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,搖勻,置于2～8℃,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品處理

將一定質(zhì)量的淀粉生物粘附材料分別與已配制成一定濃度的巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和N-乙酰葡萄糖胺溶液反應(yīng)2 h,反應(yīng)后將反應(yīng)液以8 000 r·min-1高速離心3 min,取上清液,用0.2μm濾膜過濾后,進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分離和檢測。

1.4 試驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX N H2(250 mm×4.6 mm×5μm);流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水)=80∶20的溶液;流速:0.6 mL· min-1;柱溫:常溫;進(jìn)樣量:10μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源負(fù)電子掃描(ESI-),多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);毛細(xì)管電壓: 4 000 V;霧化氣壓力:0.138 MPa;干燥氣流量: 10 L·min-1;干燥氣溫度:250℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

取20 mg·L-1的巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別將其標(biāo)準(zhǔn)溶液采用直接注射進(jìn)樣法注入離子源中,在電噴霧負(fù)離子電離方式下進(jìn)行母離子全掃描,對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,質(zhì)譜條件主要是掃描范圍、毛細(xì)管出口電壓和錐孔電壓,得到目標(biāo)物質(zhì)的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰,確定巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺的準(zhǔn)分子離子峰分別是 m/z163、179、193和220。分別以上述離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,采用全掃描的二級離子質(zhì)譜圖得到碎片離子信息,然后再對得到的目標(biāo)物質(zhì)的二級質(zhì)譜碎裂電壓進(jìn)行優(yōu)化。為了增加檢測的靈敏度,以MRM模式調(diào)諧二級質(zhì)譜碎裂電壓,即MRM碰撞能量,使每種糖類物質(zhì)的母離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對相對強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)為最佳。4種糖類物質(zhì)的一級及二級質(zhì)譜圖示于圖1,優(yōu)化后的巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺的質(zhì)譜分析條件列于表1。

由圖1(a2)可見,巖藻糖二級質(zhì)譜的主要特征碎片離子是 m/z145和 m/z89,各特征碎片離子歸屬如下:m/z145為巖藻糖分子離子的失水峰[M-H2O-H]-;m/z89為巖藻糖分子離子裂解后所產(chǎn)生的丁二醇分子的碎片離子峰。

由圖1(b2)可見,半乳糖二級質(zhì)譜的主要特征碎片離子是 m/z161、143和89,各特征碎片離子歸屬如下:m/z161為半乳糖分子離子的失水峰[M-H2O-H]-;m/z143為半乳糖分子離子失去2個(gè)水的離子峰[M-2H2O-H]-; m/z89為半乳糖分子裂解后所產(chǎn)生的丁二醇分子的碎片離子峰。

由圖1(c2)可見,α-甲基甘露糖苷二級質(zhì)譜的主要特征碎片離子是m/z161、145和101,各特征碎片離子歸屬如下:m/z161為α-甲基甘露糖苷分子經(jīng)碰撞后丟失甲基后的失水峰[MCH3-H2O]-;m/z145為α-甲基甘露糖苷分子經(jīng)碰撞后丟失甲氧基后的失水峰[M-OCH3-H2O]-;m/z101為α-甲基甘露糖苷分子裂解后所產(chǎn)生的戊烯二醇分子的碎片離子峰。

由圖1(d2)可見,N-乙酰葡萄糖胺二級質(zhì)譜的主要特征碎片離子是m/z119和101,各特征碎片離子歸屬如下:m/z119為α-甲基甘露糖苷分子裂解后所產(chǎn)生的戊三醇分子的碎片離子峰; m/z101為戊三醇分子離子進(jìn)一步失水后所產(chǎn)生的戊烯二醇分子的碎片離子峰。

由以上4種糖類物質(zhì)二級質(zhì)譜圖碎片離子分析可知,糖類物質(zhì)分子在二級電離過程中易丟失水分子形成失水峰,并且也較易獲得穩(wěn)定度較高的多元醇分子或烯醇分子的碎片離子。巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺二級質(zhì)譜圖中,離子強(qiáng)度最高的碎片離子分別為m/z89、89、101和119,因此以 m/z89(163), m/z89(179),m/z101(193)和m/z119(220)分別作為對應(yīng)糖類物質(zhì)定量分析時(shí)的定量離子。

表1 巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和N-乙酰葡萄糖胺的質(zhì)譜分析條件Table 1 The analysis parameters of mass spectrum of fucose,galactose,α-methyl mannoside andN-acetylglucosamine

圖1 4種糖類物質(zhì)的一級和二級質(zhì)譜圖(a1)、(a2)巖藻糖;(b1)、(b2)半乳糖;(c1)、(c2)α-甲基甘露糖苷;(d1)、(d2)N-乙酰葡萄糖胺Fig.1 ESI(-)-MS and ESI(-)-MS/MS product-ion mass spectra of glucide (a1),(a2)fucose;(b1),(b2)galactose;(c1),(c2)α-methyl mannoside;(d1),(d2)N-acetylglucosamine

2.2 液相分析

分離糖類物質(zhì)所采用的色譜柱主要有兩類,即氨基柱和糖柱[5]。糖柱采用的是水作為流動(dòng)相,在質(zhì)譜分析階段純水會(huì)影響質(zhì)譜的離子強(qiáng)度,而氨基柱使用了乙腈-水作為流動(dòng)相,因此最終采用氨基色譜柱。

流動(dòng)相中乙腈含量的多少直接影響分離效果。增加有機(jī)相有利于4種糖類物質(zhì)組分間的分離;相反,增加水相比例有利于糖類的溶解,但不利于各組分間的分離。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn),最終確定流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=80∶20的溶液。巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取子離子色譜圖示于圖2,以m/z89(163),m/z89(179),m/z101(193)和m/z119(220)分別作為4種糖類物質(zhì)的提取離子。從圖2可以看出,4種糖類物質(zhì)得到較好的分離,各組分分析時(shí)間短,均可在8 min內(nèi)完成。因此本方法可用于單獨(dú)快速測定4類糖類物質(zhì)的特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn),同時(shí)也可滿足混合樣品的分析,樣品中各糖類物質(zhì)的提取子離子色譜圖示于圖3。

圖2 4種糖類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取子離子色譜圖Fig.2 The extracted ion chromatogram of standard glucide

圖3 樣品中4種糖類物質(zhì)的提取子離子色譜圖Fig.3 The extracted ion chromatogram of samples

2.3 線性范圍

取巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別用超純水配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為1.0、10.0、20.0、30.0和40.0 mg·L-1,半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為1.0、10.0、20.0、40.0、60.0和80.0 mg·L-1。

以標(biāo)準(zhǔn)濃度為 x軸,峰面積為 y軸,進(jìn)行回歸分析,經(jīng)“1/X”權(quán)重可得回歸方程:巖藻糖回歸方程為 y=-3.27×103+4.35×103x,r= 0.994 5;半乳糖回歸方程為 y=2.96×103+ 1.20×103x,r=0.999 6;α-甲基甘露糖苷回歸方程為 y= -1.03×102+1.18 ×103x, r=0.998 7;N-乙酰葡萄糖胺回歸方程為 y= -1.03×104+4.63×103x,r=0.999 3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在1.0～40.0 mg·L-1范圍內(nèi),巖藻糖具有良好的線性關(guān)系,半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺在1.0～80.0 mg·L-1范圍內(nèi)同樣也具有良好的線性關(guān)系,它們都符合定量的要求。

2.4 回收率和精密度試驗(yàn)

用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),對方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行考察。在空白樣品中精密加入巖藻糖、半乳糖、α-甲基甘露糖苷和 N-乙酰葡萄糖胺的標(biāo)樣溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果列于表2。

2.5 靈敏度

依據(jù)樣品的處理方法和測試條件,采用質(zhì)譜進(jìn)行定量分析時(shí),4種糖類物質(zhì)的方法檢出限(S/N≥3)分別為0.1 mg·L-1(巖藻糖)、1.0 mg·L-1(半乳糖)、0.1 mg·L-1(α-甲基甘露糖苷)和0.5 mg·L-1(N-乙酰葡萄糖胺)。

表2 回收率與精密度測定結(jié)果(n=5)Table 2 Results of tests for recovery and precision of the method(n=5)

3 結(jié) 論

本工作建立了快速靈敏的檢測與淀粉生物粘附材料特異性結(jié)合的4種細(xì)胞表面含有的糖類物質(zhì)含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法,通過離子阱質(zhì)譜的多級質(zhì)譜功能對樣品進(jìn)行定性及精確定量分析。本方法樣品直接離心過濾后即可進(jìn)樣,大大簡化了樣品處理步驟,提高分析效率,而且靈敏度高,分析時(shí)間短,回收率為111.0%～91.0%,重現(xiàn)性好,能滿足生物樣品分析方法的有關(guān)要求,為淀粉生物粘附材料與細(xì)胞表面糖類物質(zhì)的特異性結(jié)合評價(jià)提供了可靠的分析方法,同時(shí)也為其他領(lǐng)域中糖類物質(zhì)含量的測定提供了可借鑒的方法。

[1]王 健,畢殿洲.生物粘附材料的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,19(5):373-380.

[2]HAL TNER E,EASSON J H,L EHR C M.Lectins and bacterial invasion factors for controlling endo-and transcytosis of bioadhesive drug carrier systems[J].Eur J Pharm Biopharm,1997,44:3-13.

[3]CLARK M A,J EPSON M A,SIMMONS N L,et al.Differential expression of lectin-binding sites defines mouse intestinal Mcells[J].J Histochem Cytochem,1993,41:1 679-1 687.

[4]林炎坤.常用的幾種蒽酮比色定糖法的比較和改進(jìn)[J].植物生理學(xué)通報(bào),1989,(4):53-55.

[5]王 靜,王 晴,向文勝.色譜法在糖類化合物分析中的應(yīng)用 [J].分析化學(xué),2001,29(2): 222-227.

[6]徐 瑾.高效凝膠滲透色譜及高效液相色譜和電噴霧-離子阱質(zhì)譜法聯(lián)用測定構(gòu)成蘆薈多糖的單糖[J].理化檢測:化學(xué)分冊,2008,44(12):1 133-1 136.

[7]孫志偉,劉凌君,戶寶軍,等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑的制備及其在高效液相色譜-質(zhì)譜法測定糖類化合物中的應(yīng)用[J].色譜, 2008,26(2):200-205.

[8]CAPPIELLOA A,TRUFELLIA H,FAMIGLINIA G,et al.Study on the oligosaccharides composition of the water soluble fraction of marine mucilage by electrospray tandem mass spectrometry [J].Water Research,2007,41:2 911-2 920.

[9]WAN E C H,YU J Z.Determination of sugar compounds in atmospheric aerosols by liquid chromatography combined with positive electrospray ionization mass spectrometry[J].J Chromatogr A, 2006,1 107:175-181.

[10]胡 強(qiáng),徐紅兵,李水軍,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿中乳果糖、甘露醇和乳糖含量[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(13):1 810-1 817.

[11]BRUNO D,RUEDI A.mass spectrometry and protein analysis[J]. Science,2006,312: 212-217.

Rapid Detection of Glucide Specifically Linking with Starch Bioadhesive Materials by HPLC-MS/MS

XIANG Hong1,ZHU Bin1,WAN G Xue-yu2,LIU Zao2,LI Xiao-xi2,XU Xin-rong1,CHEN Ling2
(1.A nalytical and Testing Center,South China University ofTechnology,Guangzhou510641,China; 2.School of Light Chemistry and Food Science,South China University ofTechnology,Guangzhou510641,China)

A method was developed in determining 4 kinds of glucides which were fucose,galactose,α-methyl mannoside andN-acetylglucosamine,in experiment of adhesive property between starch bioadhesive materials and sugar residues by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was filtrated and analyzed by HPLC-MS/MS.Analyte was separated by liquid chromatography with a mobile phase consisting ofV(acetonitrile)∶V(water)=80∶20.The mass spectrometer was opera-ted at the negative ion mode via electrospray ionization(ESI)source.The quantitative analysis was determined by the multiple reactions monitoring(MRM).Linear relationship between values of peak area of detection signals and concentration of fucose are obtained in the ranges of 1.0—40.0 mg·L-1,while relationships of galactose,α-methyl mannoside andN-acetylglucosamine are obtained in the range of the linear ranges 1.0—80.0 mg·L-1.The recovery rate of fucose is 111%,and the RSD is 6.55%.The recoveries rates of galactose, α-methyl mannoside andN-acetylglucosamine are 106.5%,99.0%and 91.0%,the RSDs are 7.78%,6.64%and 5.68%,respectively.Limits of detection(S/N≥3)for fucose,galactose,α-methyl mannoside andN-acetylglucosamine are 0.1,1.0,0.1 and 0.5 mg·L-1, respectively.The method is proved to be rapid,reliable and sensitive,which is suitable for estimating the specific linking between starch bioadhesive materials and glucides.The proposed method is also suitable for rapid determination of glucides components in other complex system.

starch bioadhesive materials;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);glucides

O 657.63

A

1004-2997(2010)05-291-06

2009-11-09;

2010-03-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20606014);國家支撐項(xiàng)目(2006BAD27B04)資助

向 弘(1980～),女(土家族),工程師,從事質(zhì)譜儀測試方面研究。E-mail:hxiang@scut.edu.cn

陳 玲(1964～),女(漢族),博士,教授,從事生物材料方面研究。E-mail:felchen@scut.edu.cn