劉殿峰，孫玉成，張嘉保，高宏偉

(1.吉林大學實驗動物中心，長春 130062;2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130062)

重組蛋白轉導域－神經(jīng)肽Y融合蛋白對體外培養(yǎng)大鼠脂肪細胞的影響

劉殿峰1，孫玉成2，張嘉保1，高宏偉2

(1.吉林大學實驗動物中心，長春 130062;2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130062)

目的 探討重組蛋白轉導域－神經(jīng)肽Y融合蛋白對體外培養(yǎng)大鼠脂肪細胞的影響。方法 采用剪切消化法分離大鼠前脂肪細胞，培養(yǎng)液中添加重組PTD－NPY融合蛋白，檢測前脂肪細胞和成熟脂肪細胞的形態(tài)學變化、細胞中甘油三酯含量和甘油磷酸脫氫酶(GPDH)活性。結果 重組PTD－NPY融合蛋白處理大鼠前脂肪細胞72 h，細胞體積增大，細胞數(shù)量增加，細胞甘油三酯含量和GPDH活性升高;重組 PTD－NPY融合蛋白處理成熟脂肪細胞48h后，細胞體積明顯增大，細胞內(nèi)脂肪滴數(shù)量增加并融合成較大的脂滴，甘油三酯含量和GPDH活性均顯著升高。結論 重組PTD－NPY融合蛋白明顯促進前脂肪細胞的分化，促進脂肪細胞中甘油三酯的合成與沉積。為重組PTD－NPY融合蛋白在動物生產(chǎn)及人類疾病治療中的實際應用奠定理論基礎。

蛋白轉導域;神經(jīng)肽Y;融合蛋白;脂肪細胞

NPY(神經(jīng)肽Y，Neuropeptide Y)是中樞神經(jīng)組織含量最高的神經(jīng)肽之一，它廣泛分布于除小腦以外的腦組織和脊髓［1］，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能使動物攝食過多的神經(jīng)肽，通過其受體介導在中樞發(fā)揮其促進動物攝食等生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，動物中樞注射NPY引發(fā)強的攝食反應，其采食量、飲水量大大提高［2］;體內(nèi)最重要的產(chǎn)熱組織褐色脂肪組織熱生成減少，整個機體的能量消耗下降，最終增加能量沉積。同時，激活脂肪組織的脂蛋白酶，刺激胰島素的分泌增加，促進甘油三酯的合成及其在白色脂肪組織的沉積［3］。

動物體內(nèi)脂肪的沉積過程是脂肪細胞不斷分化和細胞內(nèi)脂肪不斷合成、蓄積的過程。脂肪細胞在分化過程中除形態(tài)學發(fā)生變化外，細胞內(nèi)也發(fā)生一系列復雜的生物化學變化。因此，脂肪細胞的分化在動物體脂沉積的調(diào)控過程中起著重要作用。本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠脂肪細胞，從分子水平、細胞水平對酵母表達的重組 PTD－NPY融合蛋白的生物學活性進行了檢測和分析，為深入研究PTD－NPY融合蛋白的結構和功能及其應用奠定了基礎，對重組PTD－NPY融合蛋白在動物生產(chǎn)及人類肥胖癥治療中的實際應用具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 PTD－NPY融合蛋白:純化的酵母表達重組PTD－NPY融合蛋白，自行制備，濃度為1.0 mg/mL，溶于生理鹽水中，0.22 μm過濾除菌。

1.1.2 組織來源:成年清潔級雄性Wistar大鼠購自吉林大學實驗動物中心［SCXK(吉)2007－30003］，大鼠體重約200 g。斷頸處死后，無菌切取兩側腹股溝皮下脂肪墊。

1.1.3 主要試劑與耗材:DMEM/F12培養(yǎng)基(1∶1)，胎牛血清，Ⅰ型膠原酶，HEPES，牛轉鐵蛋白，青、鏈霉素粉劑均購自 Gibco公司;L－谷氨酰胺、丙酮酸鈉、油紅O、吉姆薩染料、牛血清白蛋白、二羥基丙酮轉移酶、三乙醇胺、β－巰基乙醇、NADH等購自Sigma公司;實驗所需無機試劑均系國產(chǎn)分析純，細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、離心管等耗材購自美國Corning公司。

1.1.4 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(Sanyo)，倒置顯微鏡(IX－71，日本 Olympus)，超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，砂芯過濾裝置(江蘇長城玻璃儀器廠)，低速水平離心機(北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品)，高速臺式冷凍離心機(德國 Sorvial)，JY92－2D型超聲波破碎儀(寧波新芝科學儀器研究所)、Beckman LX 20全自動生化分析儀(美國)、紫外分光光度計 UV－2501PC(日本島津)。

1.2 方法

1.2.1 前脂肪細胞的分離培養(yǎng):將切取的其雙側腹股溝脂肪墊用D－Hank＇s液漂洗4次，分離去除脂肪組織中肉眼可見的纖維成分及血管。用眼科剪將脂肪墊剪成約2 mm×2 mm的小塊或更細，加入0.2%Ⅰ型膠原酶和牛血清白蛋白的混合消化液，置于37℃空氣搖床內(nèi)，以150 r/min搖動消化90 min，其間每隔30 min搖勻1次。將消化后的混合液用200目尼龍網(wǎng)過濾。取濾過液，以去除漂浮的脂肪細胞及消化液，D－Hank＇s液洗滌，1500 r/min 離心15 min，棄上清液，加紅細胞裂解液室溫放置10 min，1500 r/min離心10 min，以去除污染的紅細胞，沉積的細胞再加入含5%胎牛血清的DMEM/F－12培養(yǎng)基，吹打均勻制成細胞懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)。將所獲得的細胞以1×105/mL的密度接種于3個24孔培養(yǎng)板內(nèi)，放置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，換用分化培養(yǎng)液誘導和維持脂肪細胞分化，以后每2d更換一次分化培養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況［4］。

1.2.2 PTD－NPY融合蛋白對前脂肪細胞分化的影響:當前脂肪細胞分化至第4天，開始蓄積脂肪滴時，向4個細胞培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基中加入PTD－NPY融合蛋白，每個細胞培養(yǎng)孔加20 μg，另外設2個對照孔。37℃培養(yǎng)72 h，油紅 O染色拍照，計數(shù)每孔的細胞數(shù)，并測定細胞甘油三酯含量及 GPDH的活性。

1.2.3 PTD－NPY融合蛋白對脂肪細胞的影響:當前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞時，向4個細胞培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基中加入PTD－NPY融合蛋白，每個細胞培養(yǎng)孔加20 μg，另外設2個對照孔。37℃培養(yǎng)48 h，油紅O染色拍照，測定細胞內(nèi)甘油三酯含量及GPDH活性。

1.2.4 前脂肪細胞染色:吸出細胞孔的培養(yǎng)液，用蒸餾水洗滌1次，加入10%甲醛 PBS緩沖液固定10 min，蒸餾水洗滌1次，然后用吉姆薩工作液浸染5 min，吸出染液，用蒸餾水洗滌2次，干燥后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 脂肪細胞的染色:吸出細胞孔培養(yǎng)液，用蒸餾水洗滌 1次，加入10%甲醛 PBS緩沖液固定10 min，蒸餾水洗滌1次，然后用油紅O工作液浸染60 min，吸出染液，用蒸餾水洗滌2次，干燥后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 細胞形態(tài)學觀察:對從腹股溝脂肪墊脂肪組織分離培養(yǎng)的前脂肪細胞，每天顯微鏡下觀察細胞生長過程中形態(tài)的變化，當細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化后，及時染色拍照。

1.2.7 脂肪細胞中甘油三酯含量的測定:采用Ramirez等［2］介紹的油紅O染色提取法測定細胞內(nèi)甘油三酯的含量。吸出細胞孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用蒸餾水洗滌1次，然后用10%甲醛PBS等滲鹽緩沖液固定培養(yǎng)板上貼壁細胞1 h后，蒸餾水洗滌1次。用1 mL油紅O工作液浸染2 h，吸出油紅O工作液，蒸餾水洗滌細胞培養(yǎng)板3次，然后加入2 mL異丙醇萃取20 min，萃取液用分光光度計測510 nm的A值。

1.2.8 脂肪細胞GPDH活性的測定:吸出細胞孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用 PBS(pH 7.4)洗滌2次，然后用1 mL預冷的含1 mmol/L EDTA(pH 7.5)的25 mmol/L Tris－HCl緩沖液收獲細胞，細胞懸液用超聲裂解破碎細胞，4℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液加入1 mL GPDH底物溶液，最后加入 200 μL 2mmol/L磷酸二羥丙酮，25℃反應10 min，分光光度計測定340 nm的A值。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值 ±標準差表示，應用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著用 One－Way ANOVA方差分析，進行Duncan＇s LSD檢驗。

2 結果

2.1 原代培養(yǎng)的大鼠前脂肪細胞形態(tài)學觀察

脂肪組織經(jīng)酶消化法處理獲得的細胞接種于培養(yǎng)板后3 h左右即開始貼壁，起初為類圓形或小圓形細胞，大小相似，核/漿比例較大。第4天觀察到細胞數(shù)量增多，大部分發(fā)育分化為梭形細胞，分布較均勻，倒置顯微鏡下可見細胞質內(nèi)出現(xiàn)反光的脂肪顆粒(圖1A)。第7天左右此梭形細胞大量增殖，大約長滿細胞培養(yǎng)板的80%，充脂細胞增多，脂滴大小不等且多散在，脂肪顆粒先在細胞核周圍出現(xiàn)，可見小脂滴融合成大脂滴的現(xiàn)象，細胞形狀由多角梭形變?yōu)闄E圓形和(或)圓形(圖1B)。第10天左右觀察到細胞內(nèi)積聚了大量脂肪顆粒，形態(tài)呈橢圓形、圓形(圖1C)。到第14天左右脂滴開始逐漸匯合，充滿細胞的大部分，分化成多脂滴或單脂滴細胞，大部分細胞已分化為成熟的前脂肪細胞(圖1D)。

體外培養(yǎng)的脂肪細胞體積較大，光鏡下觀察細胞膜薄，輪廓不光滑，胞質內(nèi)有大量圓形脂滴，大小不等且多散在，也有小脂滴融合成大脂滴的情況;培養(yǎng)7 d和10 d的細胞經(jīng)油紅O染色后于普通光鏡下觀察，可見細胞內(nèi)出現(xiàn)紅染顆粒(圖1B，1C)，這是由于親中性脂的油紅呈橘紅色，證明細胞內(nèi)顆粒確為脂滴。圖1見彩插7。

2.2 PTD-NPY融合蛋白對體外培養(yǎng)的前脂肪細胞分化的影響

PTD－NPY融合蛋白對大鼠前脂肪細胞分化的影響如圖2所示。與對照孔(未加 PTD－NPY處理)比較，使用PTD－NPY融合蛋白處理前脂肪細胞72 h后，可以使細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化(如圖2所示，彩插7)。A為培養(yǎng)分化第4天的前脂肪細胞，細胞呈梭形，胞質內(nèi)開始有脂肪滴蓄積。B為對照組前脂肪細胞，未經(jīng)PTD－NPY融合蛋白處理，繼續(xù)培養(yǎng)72 h;C為 PTD－NPY融合蛋白處理 72 h的前脂肪細胞。從圖中可以看出，對照組的前脂肪細胞分化正常，脂肪細胞已經(jīng)由梭形變?yōu)閳A形或橢圓形，胞質內(nèi)充有大量脂滴。與之相比，用重組PTD－NPY融合蛋白處理72h的前脂肪細胞，圓形或橢圓形脂肪細胞的體積較大，尤其是細胞內(nèi)的脂滴量增多，充滿整個胞質，且脂滴圓潤。同時，PTD－NPY融合蛋白處理組前脂肪細胞數(shù)量有明顯增多，與對照組相比增加了 39.7%(圖 3，P ＜0.05)，表明重組 PTD－NPY 融合蛋白可以促進前脂肪細胞的分化。

圖3 PTD－NPY對體外培養(yǎng)的前脂肪細胞數(shù)的影響Fig.3 Effect of PTD－NPY fusion protein on the number of preadipocytes in culture in vitro(* P＜0.05)

此外，PTD－NPY融合蛋白處理的前脂肪細胞中甘油三酯的含量和甘油磷酸脫氫酶(GPDH)活性的改變也表明PTD－NPY融合蛋白對前脂肪細胞分化具有促進作用。如圖4和圖5所示，PTD－NPY融合蛋白作用72 h后，前脂肪細胞中甘油三酯的含量和GPDH活性均顯著升高。與對照組相比，前脂肪細胞中甘油三酯的含量增加 4.57倍(P＜0.01)，GPDH活性升高3.19倍(P＜0.01)。

2.3 PTD-NPY融合蛋白對體外培養(yǎng)的鼠脂肪細胞的影響

PTD－NPY融合蛋白對體外培養(yǎng)的成熟大鼠脂肪細胞的影響如圖6(彩插7)所示，與對照組脂肪細胞比較，用PTD－NPY融合蛋白處理的成熟脂肪細胞體積明顯增大，細胞內(nèi)脂肪滴數(shù)量增加。同時我們還檢測了PTD－NPY融合蛋白對細胞中甘油三酯的含量和GPDH活性的影響。如圖7和圖8所示，培養(yǎng)液中添加入 PTD－NPY融合蛋白48 h后，脂肪細胞中甘油三酯的含量顯著升高，與對照組相比增加了2.15倍(P＜0.01);GPDH活性也顯著升高，與對照組相比，GPDH活性升高2.01倍(P＜0.01)，說明PTD－NPY融合蛋白可降低脂肪細胞的脂肪代謝，促進成熟脂肪細胞中甘油三酯的合成與沉積。

圖4 PTD－NPY融合蛋白對前脂肪細胞中甘油三酯含量的影響Fig.4 The effect of PTD－NPY fusion protein on the triglyceride content in in vitro cultured preadipocytes(**P＜0.01)

圖5 PTD－NPY融合蛋白對前脂肪細胞GPDH活性的影響Fig.5 The effect of PTD－NPY fusion protein on the GPDH activity of preadipocytes(**P＜0.01)

圖7 PTD－NPY融合蛋白對成熟脂肪細胞中甘油三酯含量的影響Fig.7 The effect of PTD－NPY fusion protein on the triglyceride content in mature cultured adipocytes(**P＜0.01)

圖8 PTD－NPY融合蛋白對成熟脂肪細胞GPDH活性的影響Fig.8 The effect of PTD－NPY fusion protein on the GPDH activity of mature adipocytes(**P＜0.01)

3 討論

神經(jīng)肽Y通過其受體介導在中樞發(fā)揮其促進動物攝食等生物學功能。NPY與Y1或Y5受體結合并引發(fā)傳出信號，抑制交感神經(jīng)，興奮副交感神經(jīng)，增加食欲和采食量，促進消化，加強同化作用［7］。在分子水平上，棕色脂肪中的解偶聯(lián)蛋白水平下降，白色脂肪組織中脂蛋白酯酶mRNA水平升高，生脂作用增強，增加體脂含量。研究發(fā)現(xiàn)，動物中樞注射NPY引發(fā)強的攝食反應，其采食量、飲水量大大提高;體內(nèi)最重要的產(chǎn)熱組織褐色脂肪組織熱生成減少，整個機體的能量消耗下降，最終增加能量沉積。同時，激活脂肪組織的脂蛋白酶，促進甘油三酯的合成和在白色脂肪組織的沉積［8］。在這個過程中，NPY也間接地促進胰島素的分泌，從而增加肝糖原、甘油三酯的合成，增加葡萄糖和脂肪酸在脂肪中的沉積［9］。

前脂肪細胞是一類具有增殖和向脂肪細胞分化能力的特異化細胞，它持續(xù)存在和作用于動物的一生［10］。前脂肪細胞的原代培養(yǎng)能保持細胞的生物學特性，便于直接觀察各種因素對細胞分化過程的調(diào)控機制，是研究脂肪組織的理想模型，也是脂肪代謝及其相關機制研究的重要細胞模型。動物體內(nèi)脂肪的沉積過程是脂肪細胞不斷分化和細胞內(nèi)脂肪不斷合成、蓄積的過程。脂肪細胞在分化過程中除形態(tài)學發(fā)生變化外，細胞內(nèi)也發(fā)生一系列復雜的生物化學變化。因此，脂肪細胞的分化在動物體脂沉積的調(diào)控過程中起著重要作用。前脂肪細胞為淺表脂肪沉積，與其他深層脂肪組織相比，其增殖和分化能力都很低。外源性NPY可直接刺激體外培養(yǎng)的大鼠前脂肪細胞，加速其分化與增殖，促進前脂肪細胞轉化為成熟的脂肪細胞。使細胞生長加速，細胞體積增大，胞內(nèi)脂肪滴增多，細胞的甘油三酯含量與GPDH活性明顯升高。

對于成熟脂肪細胞，NPY可增加細胞內(nèi)與脂類合成有關的酶類的表達，促進細胞內(nèi)甘油三酯等脂類的合成與沉積，使體脂儲存增加。

本實驗首先從細胞水平對 PTD－NPY融合蛋白的生物學活性進行了檢測。采用原代大鼠脂肪細胞培養(yǎng)的方式觀察 PTD－NPY融合蛋白對脂肪細胞的作用，在原代細胞培養(yǎng)到第4天時，向培養(yǎng)基中加入重組 PTD－NPY融合蛋白 10μg/mL，72 h后，可見細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。細胞變?yōu)閳A形，胞質內(nèi)充滿脂肪滴。同時檢測細胞內(nèi)甘油三酯的含量和甘油磷酸脫氫酶活性。結果表明，細胞甘油三酯含量明顯增加，甘油磷酸脫氫酶(GPDH)活性顯著升高，同時伴有細胞數(shù)的顯著增加。這表明我們所利用酵母分泌表達的重組PTD－NPY融合蛋白具有刺激大鼠前脂肪細胞分化增殖的作用。選擇72 h作用時間是為了確保所有適應性代謝反應和旁分泌反應的發(fā)生。甘油三酯含量和GPDH活性是脂肪細胞分化的標志。GPDH活性是脂肪細胞分化末期的主要標志，可忠實地反映前脂肪細胞中甘油三酯的含量［11］，但在脂肪細胞分化的第1～4天，主要是細胞形態(tài)的改變，細胞內(nèi)沒有甘油三酯的蓄積。而在第4天后，前脂肪細胞開始蓄積甘油三酯，GPDH活性升高。因此，選擇第4天的細胞進行實驗。

我們還觀察了 PTD－NPY融合蛋白對成熟脂肪細胞的影響。在前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞后，在培養(yǎng)基中加入重組 PTD－NPY融合蛋白，48h后細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細胞體積增大，細胞內(nèi)的脂肪滴增多，并出現(xiàn)小脂滴融合形成大脂滴。同時細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著升高，說明重組PTD－NPY融合蛋白可促進體外培養(yǎng)的成熟脂肪細胞的脂肪代謝，促進細胞內(nèi)脂類的合成與沉積，具有較好的生物學活性。此外，在培養(yǎng)基中加入重組PTD－NPY融合蛋白48h后，與對照組相比，PTD－NPY融合蛋白顯著增加成熟脂肪細胞的 GPDH活性，進一步證明NPY蛋白可增加細胞內(nèi)與脂類合成有關的酶類的表達與活性，從而促進細胞內(nèi)甘油三酯等脂類的合成。

綜上所述，通過體外細胞培養(yǎng)實驗，證明本研究通過酵母分泌表達的重組 PTD－NPY融合蛋白具有較好的生物學活性，為今后的研究與應用奠定了基礎。

(本文圖 1，2，6 見彩插 7。)

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Effects of Recombinant PTD-NPY Fusion Protein on Rat Adipocytes in Vitro

LIU Dian－feng1，SUN Yu－cheng2，ZHANG Jia－bao1，GAO Hong－wei2
(1.Laboratory Animal Center，Jilin University，Changchun 130062，China;2.Institute of Military Veterinary Medicine，Academy of Military Medical Sciences，130062 Changchun，China)

ObjectiveTo investigate the effects of recombinant PTD－NPY fusion protein on rat adipocytes in vitro.MethodsRat primary adipocytes were isolated by shearing and digestion.The morphological changes，triglyceride content and GPDH activity were detected.ResultsAfter treatment with PTD－NPY fusion protein for 72 h，the differentiation of preadipocytes was promoted obviously，bulk of cells was enlarged，and cell quantity，triglyceride content and activity of GPDH were increased.Treated with PTD－NPY fusion protein for 48 h，the fat synthesis function of mature adipocytes was promoted，fat deposit in adipocytes was increased and fusing into larger fat drops，and triglyceride content and activity of GPDH were increased significantly.ConclusionsThe results indicate that recombinant fusion protein can promote triglyceride synthesis and deposition in adipocytes.It provides a solid material foundation for its further application in studies of animal production and treatment of human related diseases.

Protein transduction domain;Neuropeptide Y;Fusion protein;Adipocytes;Rat

R349.15

A

1005－4847(2010)06－0475－05

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.006

2010－08－02

注：A. 前脂肪細胞培養(yǎng)4d；B. 前脂肪細胞培養(yǎng)7d, 油紅O染色；C. 前脂肪細胞培養(yǎng)10d, 油紅O染色；D. 前脂肪細胞培養(yǎng)14 d.
圖1 原代培養(yǎng)的大鼠前脂肪細胞形態(tài)學
Note:A. preadipocytes cultured for 4 days; B.preadipocytes cultured for 7 days, oil red O staining; C. preadipocytes cultured for 10 days, oil red O staining; D. preadipocytes cultured for 14 days.
Fig.1 Morphology of rat preadipocytes in primary culture

注：A. 培養(yǎng)4d的前脂肪細胞；B. 對照孔；C. PTD-NPY融合蛋白處理72h的前脂肪細胞。
圖2 PTD-NPY融合蛋白對前脂肪細胞分化的影響（油紅O染色）
Note:A. preadipocytes differentiated for 4 days; B. preadipocytes in control well; C. preadipocytes treated with recombinant PTD-NPY fusion protein for 72 h.
Fig.2 Effect of PTD-NPY fusion protein on the differentiation of preadipocytes (oil red O staining)

注：A. PTD-NPY融合蛋白處理的脂肪細胞；B. 對照孔。
圖6 PTD-NPY融合蛋白對成熟脂肪細胞的影響
Note: A. adipocytes treated with PTD-NPY fusion protein; B. Control.
Fig.6 The effect of PTD-NPY fusion protein on mature adipocytes

劉殿峰(1963－)男，博士，教授，研究方向:實驗動物遺傳育種與轉基因動物。E－mail:ccldf@163.com

高宏偉，Tel:0431－86985801;E－mail:gaohongweighw@hotmail.com