劉元?jiǎng)?，張晨，程欲，劉樹滔，饒平?/p>

(福州大學(xué) 生物工程研究所，福州 350002)

局部應(yīng)用PTD－SOD、SOD對小鼠皮膚創(chuàng)傷的抗氧化應(yīng)激損傷保護(hù)效果及其比較

劉元?jiǎng)?，張晨，程欲，劉樹滔，饒平?/p>

(福州大學(xué) 生物工程研究所，福州 350002)

目的 探討局部應(yīng)用PTD－SOD、SOD對小鼠皮膚創(chuàng)傷的抗氧化應(yīng)激損傷保護(hù)效果及其差異。方法制備機(jī)械性創(chuàng)傷小鼠模型和不同濃度的PTD－SOD(1000、3000、6000 U)及SOD(1000、3000、6000 U)溶液，分別用上述溶液進(jìn)行治療，同時(shí)設(shè)立模型對照組和生理鹽水對照組，各組均連續(xù)治療13 d。觀察各組創(chuàng)傷愈合情況，記錄創(chuàng)傷愈合率和愈合天數(shù);于創(chuàng)傷后第14天取各組小鼠創(chuàng)傷愈合部位皮膚，一部分制成10% 組織勻漿液用于檢測抗氧化酶(SOD、CAT、GSH－Px)活性及丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(Hyp)含量，一部分制成病理組織切片用于皮膚組織學(xué)觀察。結(jié)果 ①與模型對照組相比，PTD－SOD各組或SOD各組的抗氧化酶活性和Hyp含量顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)升高，MDA含量顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)降低，能顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)提高創(chuàng)傷愈合率、縮短創(chuàng)傷愈合時(shí)間;與生理鹽水對照組相比，結(jié)果類似。② 在同等劑量下，從促創(chuàng)傷愈合時(shí)間、抗氧化酶活性、MDA含量、Hyp含量等方面比較，PTD－SOD組明顯(P＜0.05)或極明顯(P＜0.01)優(yōu)于SOD組。③適當(dāng)劑量的PTD－SOD促創(chuàng)傷愈合效果優(yōu)于高劑量 PTD－SOD的促創(chuàng)傷愈合效果。結(jié)論 PTD－SOD或 SOD在皮膚創(chuàng)傷治療中具有良好的抗氧化應(yīng)激損傷效果，這種保護(hù)效果在創(chuàng)傷愈合的早期最顯著;同等劑量下，PTD－SOD在促創(chuàng)傷愈合的效果上明顯優(yōu)于SOD。

PTD－SOD;創(chuàng)傷愈合;氧化應(yīng)激;模型，動(dòng)物

創(chuàng)傷愈合，一直是醫(yī)學(xué)研究中最重要的課題之一。然而，其相關(guān)的研究進(jìn)展卻長期受限于缺乏合適的、理想的動(dòng)物模型和缺乏敏感的能定量反映創(chuàng)傷和創(chuàng)傷修復(fù)的方法［1］。在創(chuàng)傷應(yīng)激和炎癥時(shí)期，多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)等炎性細(xì)胞浸潤，組織中產(chǎn)生大量的氧自由基及其代謝產(chǎn)物，引起氧化應(yīng)激致使組織、細(xì)胞損害，延緩愈合。超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，是人體防御自由基損害的最重要的一道防線。外源性SOD由于無法透過細(xì)胞膜而不能有效清除自由基對胞內(nèi)組織和細(xì)胞的損害。本研究構(gòu)建了可以進(jìn)入胞內(nèi)的融合蛋 白 PTD－SOD (protein transduction domainsuperoxide dismutase，連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的超氧化物歧化酶)，前期實(shí)驗(yàn)證明了強(qiáng)大的跨膜能力［2－4］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，通過制備小鼠急性創(chuàng)傷模型，探索PTD－SOD、SOD二者在促創(chuàng)面愈合中的作用效果以及差異性，為PTD－SOD的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明雄性小鼠，108只，每只重(25±2)g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(閩)2004－0002】，統(tǒng)一喂食該中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)過程中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材

PTD－SOD凍干粉，SOD凍干粉，均由福州大學(xué)生物工程研究所通過基因工程方法生產(chǎn)，純度達(dá)電泳純，活性 PTD－SOD 2400 U/mg、SOD 1200 U/mg(均為國標(biāo)法測定)，臨用時(shí)溶于無菌生理鹽水。超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、羥脯氨酸(Hyp)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。生理鹽水購自福建永惠醫(yī)藥連鎖福州楊橋路分店?？捡R斯亮藍(lán)G 250購自美國Sigma公司。其余試劑均為市售分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

1.4 創(chuàng)傷模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周后，隨機(jī)挑選96只小鼠，每只用10%水合氯醛(每只0.06 mL)腹腔注射麻醉，背部先用電動(dòng)推剪毛后再用8%硫化鈉(含75%乙醇)脫毛，范圍3.5 cm×3.0 cm，去毛區(qū)用偏溫蒸餾水擦洗干凈。背部皮膚在自然松馳狀態(tài)下，距脊柱兩旁與脊柱平行的方向畫以邊長1.0 cm的正方形印跡，左右對稱，創(chuàng)面間隔約1.0 cm，用無菌彎曲眼科小剪刀，按印跡完整切除皮膚、淺筋膜組織，直至深筋膜淺面，邊長1.0 cm面積為1.0 cm2創(chuàng)面兩個(gè)，止血，形成機(jī)械損傷動(dòng)物模型，此日計(jì)算為0 d，各組當(dāng)日給藥，直至傷口完全愈合。造模后小鼠傷口暴露，單籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一喂食，充足給水。

1.5 動(dòng)物分組及用藥

12只未手術(shù)小鼠作為正常對照，記為第1組;將手術(shù)后的96只小鼠隨機(jī)分為8組，每組12只，各組小鼠創(chuàng)面給藥方式均為右側(cè)創(chuàng)面局部涂抹給藥，各組小鼠左側(cè)創(chuàng)面均不予用藥。第2組為模型對照組，右側(cè)創(chuàng)面不予處理;第3組為生理鹽水對照組，右側(cè)創(chuàng)面涂抹生理鹽水每次30 μL，2次/日;第4組為SOD 1000 U組，右側(cè)創(chuàng)面涂抹活力總量每次1000 U SOD，2次/日;第 5組為 SOD 3000 U 組，右側(cè)創(chuàng)面涂抹活力總量每次3000 U SOD，2次/日;第6組為SOD 6000 U組，右側(cè)創(chuàng)面涂抹活力總量每次6000 U SOD，2 次/日;第 7 組為 PTD－SOD 1000 U組，右側(cè)創(chuàng)面涂抹活力總量每次1000 U PTD－SOD，2次/日;第8組為PTD－SOD 3000 U組，右側(cè)創(chuàng)面涂抹活力總量每次3000 U PTD－SOD，2次/日;第9組為PTD－SOD 6000 U組，右側(cè)創(chuàng)面涂抹活力總量每次6000 U PTD－SOD，2 次/日。

各組用藥直到創(chuàng)面愈合為止。

1.6 創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間

創(chuàng)面愈合率用下式計(jì)算:愈合率=(原創(chuàng)面面積－現(xiàn)創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面面積 ×100%［5］。創(chuàng)面面積計(jì)算方法:以無伸縮性的透明薄膜覆于創(chuàng)面上描下創(chuàng)面輪廓，通過計(jì)算機(jī)掃描將該圖像掃描入計(jì)算機(jī)，并通過MIG 2000軟件計(jì)算出該創(chuàng)面面積。以創(chuàng)面愈合95%以上為愈合標(biāo)準(zhǔn)，記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間［6］。

1.7 標(biāo)本的取材和處理

待創(chuàng)傷各組創(chuàng)口已愈合時(shí)(第14天)處死動(dòng)物，每組10只，小鼠背部皮膚脫毛，在自然松馳狀態(tài)下，距脊柱兩旁與脊柱平行的方向畫以邊長1.0 cm的正方形印跡，左右對稱，用無菌彎曲眼科小剪刀按印跡完整切除皮膚，冰凍保存，擬作皮膚勻漿;每組另外2只，取創(chuàng)面和周緣全層皮膚，固定于4%甲醛中，擬做病理切片。

1.8 皮膚勻漿(10%)的制備和皮膚生化指標(biāo)的測定

背部脫毛皮膚組織經(jīng)預(yù)冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和結(jié)締組織，濾紙拭干，稱重，量筒量取該組織塊9倍重量預(yù)冷生理鹽水，在冰水中用組織勻漿管制成10%組織勻漿，充分勻漿、沖洗管壁，然后反復(fù)凍融勻漿3次，使其完全破碎，細(xì)胞內(nèi)容物完全游離在液相中。分別測定皮膚勻漿中 SOD、CAT、GSH－Px、MDA、Hyp 的含量，操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。溶液中蛋白質(zhì)含量測定按照考馬斯亮蘭法測定。

1.9 創(chuàng)面新生皮膚組織學(xué)觀察

常規(guī)石蠟包埋切片，沿凸起最高點(diǎn)縱行切片，切片厚5 μm，常規(guī) HE染色，在光鏡下觀察各組新生皮膚的組織病理結(jié)構(gòu)，判斷各組用藥對皮膚是否存在毒害作用。病理切片的制作委托福建醫(yī)科大學(xué)病理教研室完成。

這本書由中央黨校采訪實(shí)錄編輯室編寫，是習(xí)近平1968年-1975年在陜西延安梁家河大隊(duì)當(dāng)知青的生活實(shí)錄。全書語言樸實(shí)，用訪談的方式再現(xiàn)了習(xí)近平當(dāng)年在梁家河，與知青戰(zhàn)友、當(dāng)?shù)卮迕裰g一件件情暖人心的大事小事。他在青少年時(shí)期的那段經(jīng)歷告訴了我，凡事都有因果，青年習(xí)近平能成長為這樣一位高瞻遠(yuǎn)矚、親民務(wù)實(shí)的領(lǐng)袖人物絕非偶然。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對小鼠創(chuàng)傷平均愈合時(shí)間的影響

創(chuàng)傷小鼠各組右側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間如圖1所示，創(chuàng)傷小鼠各組左側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間如圖2所示，同只小鼠左右兩側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間比較如圖3所示。

圖1 機(jī)械性創(chuàng)傷小鼠各組右側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間Fig.1 The average healing time of the right skin mechanical wounds in each group

圖2 機(jī)械性創(chuàng)傷小鼠各組左側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間Fig.2 The average healing time of the left skin mechanical wounds in each group

圖3 同只小鼠兩側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間比較Fig.3 Comparison of the average healing time of bilateral skin wounds in the same mouse of each group

從各組右側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間來看，與創(chuàng)傷對照組或生理鹽水組相比，SOD三組促進(jìn)創(chuàng)面愈合時(shí)間縮短(0.01＜P＜0.05)，PTD－SOD三組促進(jìn)創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯縮短(P＜0.01);PTD－SOD組和 SOD組，在同等劑量下，1000 U、3000 U、6000 U 的 PTDSOD組分別比SOD組平均縮短了0.75 d、1.54 d(P＜0.01)、0.60 d;SOD組間比較差異無顯著性(P＞0.05);PTD－SOD組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。從縮短創(chuàng)面愈合的時(shí)間來看，兩者都有促創(chuàng)面愈合作用，PTD－SOD作用更明顯。同時(shí)可以看出，適當(dāng)劑量的PTD－SOD促創(chuàng)面愈合效果優(yōu)于高劑量的效果。

從各組左側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間來看，各組創(chuàng)面平均愈合時(shí)間相差不明顯，由此可見，單側(cè)涂抹給藥對于對側(cè)創(chuàng)面(創(chuàng)面面積1.0 cm2，相距1.0 cm)創(chuàng)傷愈合的影響不明顯。

從同只小鼠左右側(cè)創(chuàng)面平均愈合時(shí)間來看，模型對照組、生理鹽水組差異無顯著性(P＞0.05)，SOD 1000 U組、SOD 3000 U組、SOD 6000 U組差異有顯著性(P ＜0.01)，PTD－SOD 1000 U 組、PTDSOD 3000 U組、PTD－SOD 6000 U組差異有顯著性(P＜0.001)。平均愈合時(shí)間各組同只小鼠左右側(cè)創(chuàng)面比較結(jié)果與各組之間右側(cè)創(chuàng)面治療比較結(jié)果一致。從組間不同小鼠比較和組內(nèi)同只小鼠比較兩個(gè)方面都得出同樣的結(jié)論，由此也說明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性?？梢酝瑫r(shí)從組間、組內(nèi)兩個(gè)側(cè)面進(jìn)行比較，這也是本次實(shí)驗(yàn)造模、分組和用藥方式的一大特色。

2.2 對小鼠創(chuàng)傷平均愈合率的影響

創(chuàng)傷后第1～13天各組小鼠右側(cè)創(chuàng)面的平均愈合率如圖4(彩插14)所示，創(chuàng)傷后第1～13天各組小鼠右側(cè)創(chuàng)面每天平均愈合率增加的幅度如圖5(彩插14)所示。

從右側(cè)創(chuàng)面每天平均愈合率來看，同等劑量下，1000 U的PTD－SOD組與SOD組相比，第1～4天有顯著提高(P＜0.01)，第5～8天有明顯提高(0.01＜P＜0.05);3000 U的PTD－SOD組與SOD組相比，第1～3天有顯著提高(P＜0.01)，第4～9天有明顯提高(0.01＜P＜0.05);6000 U的 PTD－SOD組與SOD組相比，第1天和第2天有顯著提高(P＜0.01)，以后兩者差異無顯著性(P＞0.05)。

從各組創(chuàng)面平均愈合率每天增加的幅度來看，SOD組和PTD－SOD組創(chuàng)面愈合率增幅最大的是在第0～4天，尤其在前3 d最為明顯;SOD三組在第2天達(dá)最大增幅(17%以上)，而PTD－SOD三組在第1天達(dá)最大增幅(16%以上)，以3000 U PTD－SOD組增幅最大(20.4%)。由此可見，PTD－SOD和 SOD促創(chuàng)面愈合的作用并非作用于修復(fù)全過程，在創(chuàng)傷愈合前期即創(chuàng)傷后0～4 d尤其是前3 d作用最為明顯，在同等劑量下PTD－SOD的促創(chuàng)傷愈合效果明顯優(yōu)于SOD。

2.3 小鼠創(chuàng)傷愈合組織中抗氧化酶類活性和丙二醛、羥脯氨酸含量測定結(jié)果和分析

第14天小鼠創(chuàng)傷愈合組織中，抗氧化酶類活性、丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(Hyp)含量的測定結(jié)果如表1所示。

表1 第14天小鼠創(chuàng)傷愈合組織中抗氧化酶類活性和丙二醛、羥脯氨酸含量測定結(jié)果(±s，n=10)Tab.1 Measurement of the activities of antioxidases and contents of malondialdehyde(MDA)and hydroxyproline(Hyp)in the healing wounds at the 14th day after wound in each group(±s，n=10)

表1 第14天小鼠創(chuàng)傷愈合組織中抗氧化酶類活性和丙二醛、羥脯氨酸含量測定結(jié)果(±s，n=10)Tab.1 Measurement of the activities of antioxidases and contents of malondialdehyde(MDA)and hydroxyproline(Hyp)in the healing wounds at the 14th day after wound in each group(±s，n=10)

注:與正常組比較ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;與模型組或生理鹽水組比較:*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note:Compared with the normal group，ΔP ＜0.05，andΔΔP ＜0.01.Compared with the mechanical wound model group or physiological saline group，*P＜0.05，and**P＜0.01

組號(hào)Group SOD(U/mg prot)CAT(U/mg prot)GSH－Px(U/mg prot)Hyp(μg/mg prot)MDA(nmol/mg prot)1 193.382±16.536** 9.104±0.408** 20.333±0.658** 0.768±0.174** 3.488±0.209**2 148.066±9.743ΔΔ 6.336±0.763ΔΔ 15.406±1.303ΔΔ 0.582±0.139ΔΔ 4.110±0.476ΔΔ3 146.733±18.942ΔΔ 6.209±0.863ΔΔ 15.327±1.049ΔΔ 0.580±0.167ΔΔ 4.127±0.383ΔΔ4 169.634 ±24.663* 7.294 ±1.346Δ* 17.076 ±2.737Δ* 0.648 ±0.155Δ* 3.829 ±0.530Δ*5 181.660±27.047* 8.404±0.749* 19.094±1.735* 0.671±0.136* 3.801±0.494*6 174.287±19.167* 8.146±0.693* 18.378±2.387* 0.659±0.148* 3.850±0.556*7 192.481±21.742** 9.049±0.788** 20.134±1.951** 0.701±0.165* 3.689±0.438**8 210.547±16.747** 10.472±0.681** 22.092±0.989** 0.771±0.120** 3.316±0.371**9 201.297±11.942** 8.921±0.724** 21.113±2.074** 0.695±0.146* 3.696±0.648**

皮膚創(chuàng)面在愈合過程中產(chǎn)生過多的活性氧及其來源的降解產(chǎn)物，如蛋白羰基(來源于蛋白氧化產(chǎn)物)、丙二醛(來源于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物)和總的抗氧化能力指標(biāo)等，間接反映了氧化應(yīng)激的損害程度。丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，是活性氧對細(xì)胞膜和細(xì)胞器質(zhì)膜損害結(jié)果的一種特征性損害，間接評(píng)價(jià)細(xì)胞、組織受損程度?？寡趸割?SOD、CAT、GSH－Px)能有效清除自由基，是機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱的標(biāo)志。同時(shí)使用SOD、CAT、GSH－Px和MDA檢測可以更好地說明機(jī)體的抗氧化能力和氧化損傷情況［7］。從抗氧化酶活性來看，與正常組比較，模型組與生理鹽水組總抗氧化能力顯著下降(P＜0.01);SOD 1000 U組總抗氧化能力下降(0.01＜P＜0.05)，另外兩組創(chuàng)面的總抗氧化能力接近于正常組偏低一些;PTDSOD各組的總抗氧化能力與正常組相差無幾，而3000 U組與6000 U組的總抗氧化能力均已超過正常組。單從 SOD活性來看，同劑量的 PTD－SOD組與SOD組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明同等劑量下 PTD－SOD的總抗氧化能力明顯超過SOD。從 MDA含量來看，與正常組比較，模型組與生理鹽水組氧化損傷表現(xiàn)得很明顯(P＜0.01)，SOD 1000 U組也有損傷(0.01＜P＜0.05)，而 SOD 3000 U組和6000 U組以及PTD－SOD各組損傷很小(P＞0.05)。其中，尤其是 PTD－SOD 3000 U 組MDA含量已降低至正常組稍下的水平，看不到氧化損傷的痕跡，與SOD各組相比，下降均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明適量濃度的PTD－SOD保護(hù)細(xì)胞和組織抗氧化損傷的效果非常顯著。

創(chuàng)傷的愈合多通過結(jié)締組織的增生而完成，結(jié)締組織具有很強(qiáng)的再生能力，在創(chuàng)面修復(fù)過程中形成的結(jié)締組織主要是成纖維細(xì)胞及其產(chǎn)生的膠原蛋白，膠原蛋白是皮膚主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成創(chuàng)面基質(zhì)的主要組分，為創(chuàng)面修復(fù)過程中組織血管化和上皮化提供基質(zhì)支架。因此創(chuàng)面愈合過程中膠原蛋白代謝的狀況可反映創(chuàng)面愈合的情況［8］。Hyp是膠原蛋白特有的氨基酸之一，且所占比例相對恒定，因此Hyp含量可反映膠原的水平，是創(chuàng)面愈合質(zhì)量特殊而敏感的指標(biāo)之一［9］。從 Hyp含量來看，與正常組比較，模型組與生理鹽水組顯著降低(P＜0.01)，表明創(chuàng)面愈合質(zhì)量差;SOD 1000 U組也有一定程度的下降(P＜0.05)，創(chuàng)面愈合質(zhì)量不理想;SOD其他組和PTD－SOD其他組下降不明顯(P＞0.05)，促創(chuàng)面愈合后創(chuàng)面質(zhì)量較好。尤其是 PTD－SOD 3000 U組Hyp含量已比正常組水平稍高，與SOD各組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明適當(dāng)劑量下的PTD－SOD提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量的效果明顯優(yōu)于SOD，同時(shí)可以看出，過量的PTD－SOD促創(chuàng)面愈合的質(zhì)量呈下降趨勢。

2.4 創(chuàng)面新生皮膚組織病理學(xué)觀察

第14天，各組創(chuàng)口愈合后，新生皮膚的組織病理結(jié)構(gòu)如圖6所示(彩插14)。

各組新生皮膚組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，正常對照組小鼠皮膚表皮層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分層清晰，厚度正常，真皮層可見波浪狀纖維組織，排列有序，分布均勻，疏密有致，細(xì)胞成分及數(shù)量適中。模型對照組表皮層連續(xù)性好，厚度偏薄，真皮層結(jié)構(gòu)完好。各用藥組表皮、真皮、皮下組織各層結(jié)構(gòu)層次明顯、厚度適中，表皮層連續(xù)性好，真皮內(nèi)有新生纖維組織和散在毛細(xì)血管，炎癥細(xì)胞很少或基本看不到。

從新生皮膚組織病理學(xué)檢測結(jié)果來看，各治療組用藥對創(chuàng)口組織無不良影響，是安全、無毒副作用的皮膚用藥。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)造模方法的最大優(yōu)點(diǎn)是每只小鼠背部制備2個(gè)創(chuàng)面。查閱文獻(xiàn)中多報(bào)道每只小鼠背部制備1個(gè)創(chuàng)面，如制備1個(gè)，為達(dá)到可靠的樣本數(shù)量，則意味著每個(gè)實(shí)驗(yàn)需要較多數(shù)量的小鼠，加大實(shí)驗(yàn)工作量和實(shí)驗(yàn)成本;如果制備創(chuàng)面超過2個(gè)，由于受小鼠背部面積及解剖位置的影響，會(huì)造成制備的創(chuàng)面大小、深淺不統(tǒng)一，而模型中創(chuàng)面大小、形狀和深度的一致性是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的前提條件。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對比和參照付小兵的方法［10］，我們認(rèn)為每只小鼠背部制備2個(gè)創(chuàng)面(創(chuàng)面面積為1.0 cm2)比較合適。2個(gè)創(chuàng)面分別位于背部脊柱兩側(cè)，呈對稱分布，既能保證制備創(chuàng)面的均一性，又能保證一定數(shù)量的樣本含量，同時(shí)可以同只小鼠在消除個(gè)體差異性的基礎(chǔ)上比較不同藥物對創(chuàng)傷愈合的影響。

超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物體內(nèi)唯一以氧自由基為底物的酶，一直以來被認(rèn)為是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶，是體內(nèi)清除自由基第一道、也是最重要的一道防線［15］。Winterbourn［16］提出，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生自由基的不成對電子通過GSH(還原型谷胱甘肽)轉(zhuǎn)移至O2，成為可被 SOD清除的而被排除，通過SOD使得成為細(xì)胞內(nèi)自由基的“排污漕(sink)”，Koppenol［17］以熱力學(xué)理論支持了“排污漕(sink)”設(shè)想的正確性。

氧化應(yīng)激時(shí)，內(nèi)源性SOD的量相對或絕對的匱乏與不足，加之本身也是一種蛋白質(zhì)，而且含有金屬輔基及其活性中心，在氧化應(yīng)激時(shí)也會(huì)受到化學(xué)活性強(qiáng)的自由基攻擊而受到損傷。如金屬輔基Cu2+的還原或丟失、活性中心組氨酸的破壞、精氨酸(Arg 144)的變化等均可導(dǎo)致SOD活性下降或丟失。外源性 SOD由于受到物質(zhì)大小(如 Cu，Zn－SOD，一般含 2個(gè)亞基，分子量為 31×103～33×103;Mn－SOD和Fe－SOD分子量更大)和生化特性的嚴(yán)格限制，難以透過細(xì)胞膜、到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部積聚的部位，使得外源性SOD分子無法有效消除胞內(nèi)超氧陰離子自由基對創(chuàng)傷愈合造成的各種損害，大大限制了SOD在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。

本研究所從2000年開始研制的PTD(protein transduction domain，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，一類能攜帶其他生物大分子如蛋白、多肽、DNA及寡核苷酸等穿過細(xì)胞膜并使它們在細(xì)胞內(nèi)集聚的陽離子短肽［18］)融合蛋白 PTD－SOD，能有效的、無破壞性的進(jìn)入各種細(xì)胞，口服或者腹腔注射能明顯提高實(shí)驗(yàn)小鼠各種臟器的 SOD 活力［2－4］。

本實(shí)驗(yàn)從縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間、提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量等方面比較了PTD－SOD和SOD在小鼠皮膚急性創(chuàng)傷中抗氧化應(yīng)激損傷效果。結(jié)果表明，外源性SOD具有較好的抗氧化應(yīng)激損傷、促創(chuàng)面愈合能力，但效果有限;適量的外源性 PTD－SOD抗氧化應(yīng)激損傷、促創(chuàng)面愈合能力顯著優(yōu)于SOD，是高效、安全的抗氧化制劑，在創(chuàng)傷愈合早期、尤其是炎癥時(shí)期，具有非常良好的促創(chuàng)傷愈合效果。

(本文圖4～6見彩插14。)

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Protective Efficacy of Topical Application of PTD-SOD and SOD against Oxidative Stress Damage to Mouse Skin Wound

LIU Yuan－gang ，ZHANG Chen ，CHENG Yu ，LIU Shu－tao ，RAO Ping－fan
(Institute of Biotechnology of Fuzhou University，F(xiàn)uzhou 350002，China)

ObjectiveTo study the protective efficacy of topical application of PTD－SOD and SOD against oxidative stress damage to mouse skin wound and the difference between them.MethodsAcute wound healing model was prepared by removing the whole layer dorsal skin in mice.SOD and the fusion protein PTD－SOD at different concentrations were used to treat the wound for consecutive 13 days.The mice were divided into groups treated with SOD or PTD－SOD at different concentrations，model control group，and physiological saline treatment group.The right and left skin wound healing rates in each mouse of every group were recorded.On the 14th day after wound，samples of the wound healing skin were taken from all the mice.A part of them was used to make 10%tissue homogenate for detecting activities of superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)，glutathione peroxidase(GSH－Px)and contents of malondialdehyde(MDA)and hydroxyproline(Hyp);another part was fixed in 10%formalin for histopathological examination.ResultsCompared with the model control group，the skin wound healing of the SOD or PTD－SOD groups were significantly(P ＜ 0.05)or very significantly(P ＜0.01)promoted，the activities of SOD，CAT，GSH－Px and contents of Hyp were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01)，the contents of MDA were significantly decreased(P＜0.05 or P＜0.01).When compared with the physiological saline treatment group，the effect was similar to that of the model control group.At the same dosage andunder the same environmental conditions，the skin wound healing rate，increase of the activities of antioxidases and the contents of Hyp，and the decrease of contents of MDA of the PTD－SOD groups were better than those in the SOD groups.ConclusionsPTD－SOD and SOD play an important role in preventing oxidative stress damage，and promote the skin wound healing process effectively and safely.PTD－SOD is a much more powerful antioxidant than SOD.

PTD－SOD;Wound healing;Oxidative stress;Mice

R－33

A

1005－4847(2010)06－0514－06

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.014

2010－03－31

圖4 創(chuàng)傷后第1～13 天各組小鼠右側(cè)創(chuàng)面平均愈合率
Fig.4 The average wound healing rate of the right skin wounds

圖5 創(chuàng)傷后第1～13 天各組小鼠右側(cè)創(chuàng)面平均愈合率每天增加幅度
Fig.5 Everyday increase rage of the average wound healing rate of the right skin wounds

注：A. 正常對照組；B. 模型對照組；C. 生理鹽水對照組；D. SOD 1000 U組；E. SOD 3000 U組；F. SOD 6000 U組；G. PTD-SOD 1000 U組；H. PTD-SOD 3000 U組；I. PTD-SOD 6000 U組。
圖6 第14 天各組小鼠創(chuàng)傷愈合皮膚的病理組織切片(HE)
Note: A. Normal group 14th d. B. Model group 14 th d. C. Physiological saline group 14th d. D. SOD 1000 U group 14th d. E. SOD 3000 U group F. SOD 6000 U group 14th d. G. PTD-SOD 1000 U group 14th d. H. PTD-SOD 3000 U group 14th d. I. PTD-SOD 6000 U group 14th d
Fig.6 Histopathologic appearance of the mouse skin wound healing tissues of each group at 14th day after wound(HE)

劉元?jiǎng)?1981年－)，男，在讀博士。研究方向:生物制藥。

饒平凡，Email:pingfanrao@gmail.com