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      慢性應(yīng)激狀態(tài)下大鼠睪酮水平測(cè)定

      2010-09-19 01:29:50劉占東鮑曉力張進(jìn)祿劉天會(huì)趙煥英趙君朋陳珺趙媛趙紅王得新
      關(guān)鍵詞:首都醫(yī)科大學(xué)睪酮游離

      劉占東,鮑曉力,張進(jìn)祿,劉天會(huì),趙煥英,趙君朋,陳珺,趙媛,趙紅,王得新

      (1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心,北京 100050;3.首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所,北京 100067)

      慢性應(yīng)激狀態(tài)下大鼠睪酮水平測(cè)定

      劉占東1,鮑曉力2,張進(jìn)祿3,劉天會(huì)2,趙煥英3,趙君朋3,陳珺1,趙媛1,趙紅1,王得新1

      (1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心,北京 100050;3.首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所,北京 100067)

      目的 通過對(duì)于慢性應(yīng)激模型和運(yùn)動(dòng)疲勞模型大鼠的血清睪酮水平的對(duì)比研究,探討慢性應(yīng)激過程中睪酮水平變化規(guī)律及其與發(fā)生疲勞的關(guān)系。方法 建立大鼠慢性不可預(yù)測(cè)性應(yīng)激模型及運(yùn)動(dòng)性疲勞模型;應(yīng)用大鼠軌跡追蹤系統(tǒng)對(duì)不同應(yīng)激時(shí)間大鼠進(jìn)行活動(dòng)量觀測(cè),應(yīng)用放射性免疫法對(duì)各組大鼠進(jìn)行血清總睪酮和游離睪酮進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 與正常組比較,慢性應(yīng)激大鼠第1周組活動(dòng)量(運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度,下同)增加(P<0.01),第2周組活動(dòng)量下降(P<0.01)。各實(shí)驗(yàn)組大鼠游離睪酮與總睪酮之間均存在線性相關(guān)。慢性應(yīng)激各組隨應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng),其游離睪酮與總睪酮比值呈逐漸下降趨勢(shì),并且能夠達(dá)到運(yùn)動(dòng)疲勞組水平。結(jié)論 慢性應(yīng)激條件可以明顯引起大鼠睪酮水平下降。提示分層檢測(cè)慢性疲勞綜合征人群血清總睪酮及游離睪酮的水平以及進(jìn)行動(dòng)態(tài)性研究可能為本病癥的診斷提供生化指標(biāo)。以游離睪酮與總睪酮比值為指標(biāo)檢測(cè)雄性激素水平,能夠更好地反映干預(yù)因素對(duì)動(dòng)物生理上的影響。

      慢性應(yīng)激;疲勞;睪酮;慢性疲勞綜合征

      應(yīng)激是指內(nèi)外環(huán)境劇變刺激時(shí),機(jī)體出現(xiàn)的包括精神、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等的綜合應(yīng)答狀態(tài)。強(qiáng)烈身心應(yīng)激尤其是長(zhǎng)期慢性應(yīng)激嚴(yán)重影響著人類的身心健康,導(dǎo)致臨床疾病、亞健康狀態(tài)及早衰。目前認(rèn)為慢性疲勞綜合征和抑郁癥的發(fā)生均與長(zhǎng)期應(yīng)激有關(guān)。

      研究表明,在運(yùn)動(dòng)性疲勞過程中睪酮水平下降,睪酮水平與疲勞恢復(fù)程度存在相關(guān)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),懸吊、力竭性運(yùn)動(dòng)、高溫環(huán)境等均可出現(xiàn)大鼠睪酮水平降低。臨床研究發(fā)現(xiàn),一些應(yīng)用男性合成代謝類類固醇的人會(huì)表現(xiàn)出攻擊性行為,如精神錯(cuò)亂、情緒紊亂、輕度躁狂、易怒和抑郁發(fā)作等。在性腺機(jī)能不良的患者中,睪酮替代療法可以明顯改善其情緒障礙和性行為;而長(zhǎng)時(shí)間的睪酮替代能夠明顯的改善疲勞抑郁等陰性癥狀,最新研究表明低劑量的睪酮治療可以明顯改善女性抑郁癥患者的病情[1,2]。臨床上抑郁癥患者往往具有明顯的疲勞癥狀,以上證據(jù)表明,睪酮水平的變化與應(yīng)激誘發(fā)的疲勞和抑郁等癥狀之間存在著密切的關(guān)系。

      長(zhǎng)效不可預(yù)測(cè)性溫和應(yīng)激模型是目前常用的抑郁癥藥物篩選模型,它的主要設(shè)計(jì)思路是模仿人類社會(huì)經(jīng)常面對(duì)的各種應(yīng)激因素,通過不定順序的刺激方式使大鼠不能產(chǎn)生適應(yīng)而進(jìn)入疾病狀態(tài)。我們認(rèn)為該模型的設(shè)計(jì)思路與近年國外大量研究的慢性疲勞綜合征的發(fā)病特點(diǎn)相符合。本研究的主要內(nèi)容是通過對(duì)于慢性應(yīng)激模型和運(yùn)動(dòng)疲勞模型大鼠的血清睪酮水平的對(duì)比研究,探討慢性應(yīng)激過程中睪酮水平變化規(guī)律及其與疲勞發(fā)生的關(guān)系。

      1 材料和方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

      Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量200~250 g,來源于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部【SCXK(京)2007-0001】。本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。正常對(duì)照組,選取成年Wistar大鼠12只,正常飲食飲水,不給任何刺激,無需孤養(yǎng)。飼養(yǎng)3周后進(jìn)行行為軌跡記錄,脫頸取血,-80℃冷凍保存。

      1.2 應(yīng)激動(dòng)物模型及分組

      選取成年Wistar大鼠48只;共分4組,每組12只,每只單籠飼養(yǎng)。各組動(dòng)物分別在應(yīng)激干預(yù)后7、14、21和28d進(jìn)行行為軌跡記錄,每只記錄30 min后,脫頸取血,標(biāo)本-80℃冷凍保存。按照改良Katz法進(jìn)行不可預(yù)知應(yīng)激刺激[3],包括:4次24 h禁食,4次24 h斷水,4次24 h潮濕墊料(鼠盒中加水200 mL),4次4℃冷水游泳5 min,4次45℃烤箱熱烘5 min,4次1 min夾尾,4次5 min高速水平振蕩。每天隨機(jī)給予一種刺激,共刺激28 d,每種刺激不得連續(xù)給予。

      1.3 大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡的記錄

      采用清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)工程研究所設(shè)計(jì)的大鼠軌跡追蹤系統(tǒng),對(duì)正常對(duì)照組和慢性應(yīng)激大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的距離進(jìn)行量化描述。

      1.4 大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型組

      選取成年Wistar大鼠12只,飼養(yǎng)環(huán)境同正常大鼠組。

      1.4.1 適應(yīng)訓(xùn)練:采用大鼠平板式運(yùn)動(dòng)疲勞儀(Panlab公司,LE8710),每天訓(xùn)練20 min,每周 5 d,共訓(xùn)練5周。動(dòng)物適應(yīng)1~2 d后開始訓(xùn)練,采用遞增強(qiáng)度的方式進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),坡度為0度。從訓(xùn)練第1周起,每周遞增速度分別為 15、22、27、31和35 m/min。一般訓(xùn)練:每周7 d,共2周。每只動(dòng)物每日按35 m/min的速度,在坡度為0度的跑臺(tái)上跑20 min。

      1.4.2 強(qiáng)化訓(xùn)練:每周7 d,共1周。每只動(dòng)物每日按35 m/min的速度,在坡度為0度的跑臺(tái)上跑30 min。最后1周改為每日按42 m/min的速度,在坡度為0度的跑臺(tái)上跑40 min。當(dāng)最終大鼠處于運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)時(shí),每只大鼠運(yùn)動(dòng)后喘息靜臥時(shí)間達(dá)到5 s以上。在完成最后一次運(yùn)動(dòng)之后,休息1 h。脫頸取血,標(biāo)本-80℃冷凍保存[4]。

      1.5 血清總睪酮和游離睪酮的測(cè)定

      1.5.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑:DFM-96型10管放射放免γ計(jì)數(shù)器、睪酮放免試劑盒 Dsl-4000、游離睪酮放免試劑盒 Dsl-4900(Corporate Headquarrers,USA),蒸餾水、恒溫水浴箱、微量加樣器等。

      1.5.2 血清總睪酮的測(cè)定:按照睪酮和游離睪酮試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)模型為logistic四參數(shù)擬合,測(cè)定時(shí)間60 s??偛G酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù):相關(guān)系數(shù) r=-0.9999,標(biāo)準(zhǔn)誤差 SD =998.080,Bo/T=39.01%;游離睪酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù):相關(guān)系數(shù) r=-0.9974,標(biāo)準(zhǔn)誤差 SD=17.565,Bo/T=39.99%。

      2 結(jié)果

      2.1 大鼠運(yùn)動(dòng)距離記錄結(jié)果

      本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠在30 min內(nèi)的活動(dòng)距離表示活動(dòng)量,正常組和各應(yīng)激組大鼠取材前運(yùn)動(dòng)軌跡結(jié)果分別為:正常組為(33.16±4.84)m,應(yīng)激第1周組為(56.10±12.20)m,應(yīng)激第 2周組為(24.03±4.93)m,應(yīng)激第3周組為(27.39±5.76)m,應(yīng)激第4周組為(34.12±6.73)m。應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)與正常組比較,應(yīng)激第1周組大鼠活動(dòng)量明顯增加(P=0.000);第2周組大鼠活動(dòng)量較正常明顯下降(P=0.005);第3周雖然活動(dòng)距離比正常組仍縮短,但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不存在顯著性差異(P=0.073);而在應(yīng)激第4周時(shí)大鼠的活動(dòng)距離已經(jīng)基本恢復(fù)到正常組水平(P=0.763)。

      2.2 各組大鼠游離睪酮與總睪酮水平的相關(guān)性分析

      應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,通過各組大鼠游離睪酮與總睪酮水平的線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),二者之間存在高度的相關(guān)性,且各組相關(guān)系數(shù)的 P值均為0.000。其相關(guān)方程分別為:①正常組:總睪酮(ng/mL)=0.441×游離睪酮(pg/mL)+0.978,R2=0.966。②應(yīng)激第1周組:總睪酮(ng/mL)=0.693×游離睪酮(pg/mL)-1.385,R2=0.959。③應(yīng)激第 2周組:總睪酮(ng/mL)=0.568×游離睪酮(pg/mL)+0.049,R2=0.994。④應(yīng)激第 3周組:總睪酮(ng/mL)=0.641×游離睪酮(pg/mL)-0.198,R2=0.988。⑤應(yīng)激第 4周組:總睪酮(ng/mL)=0.589×游離睪酮(pg/mL)+0.134,R2=0.981。⑥運(yùn)動(dòng)疲勞組:總睪酮(ng/mL)=0.448×游離睪酮(pg/mL)+1.172,R2=0.952。

      2.3 不同組大鼠睪酮水平

      應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn),與正常組比較,應(yīng)激第4周組總睪酮水平明顯下降(P=0.022);游離睪酮總體水平呈下降趨勢(shì),其中應(yīng)激第2周組和第4周組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.029和0.008);以游離睪酮與總睪酮比值(FT/TT)作為統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)各組大鼠比正常組均出現(xiàn)下降。除應(yīng)激第1周組外,其他各組均出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中應(yīng)激第2周組為顯著性下降(P<0.05),其他各組均為非常顯著性下降(P<0.01)。結(jié)果如表1所示,其中 A、B、C、D、E、F分別代表正常組、應(yīng)激第1周組、應(yīng)激第2周組、應(yīng)激第3周組、應(yīng)激第4周組和中樞性運(yùn)動(dòng)疲勞組。

      表1 不同組大鼠睪酮(TT)和游離睪酮(FT)水平Tab.1 The testosterone(TT)and free testosterone(FT)levels in the rats of different groups

      3 討論

      本研究結(jié)果表明,運(yùn)動(dòng)疲勞模型大鼠的血睪酮和游離睪酮水平雖比正常大鼠降低,但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而游離睪酮與總睪酮的比值與正常組相比呈明顯下降(P<0.01)。在慢性應(yīng)激模型大鼠中,應(yīng)激第4周組總睪酮和游離睪酮的水平均明顯降低,第2周組游離睪酮水平也明顯下降,但總睪酮未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)激第3周組沒有出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能與該組動(dòng)物基礎(chǔ)睪酮水平偏高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)差均較大,說明不同大鼠間睪酮水平的個(gè)體差異較大。因此,如果單純以總睪酮和游離睪酮為指標(biāo)進(jìn)行研究則需要較大的樣本量。通過各組游離睪酮和總睪酮之間的線性回歸分析發(fā)現(xiàn),二者存在很好的線性相關(guān)性,因而可以采用游離睪酮與總睪酮比值作為統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析。這樣既能夠很好消除不同大鼠之間睪酮水平的個(gè)體差異,又能夠直接反映出主要發(fā)揮功能的游離睪酮水平在總睪酮中所占比例的變化情況,因而能夠比較全面的反映出干預(yù)因素對(duì)于雄性激素水平變化的作用。Kuoppasalm[5]發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)員在長(zhǎng)跑和短跑時(shí),血漿睪酮和類固醇結(jié)合球蛋白的比例不變,總睪酮和游離睪酮的變化始終是平行的。這與我們的研究結(jié)果相似。我們的結(jié)果表明,雖然大鼠在慢性應(yīng)激的不同時(shí)間點(diǎn)其游離睪酮與總睪酮總是存在線性相關(guān)關(guān)系,但其斜率是不同的。隨著應(yīng)激時(shí)間的不斷增加,大鼠游離睪酮與總睪酮的比值呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。到應(yīng)激第3、4周時(shí)該值幾乎達(dá)到運(yùn)動(dòng)性疲勞組的水平。提示在運(yùn)動(dòng)和慢性應(yīng)激條件下,大鼠游離睪酮水平的下降幅度較總睪酮大。

      睪酮主要由睪丸的間質(zhì)細(xì)胞合成,腎上腺皮質(zhì)的網(wǎng)狀帶和卵巢也能分泌少量的睪酮。睪酮的主要作用是促進(jìn)和維持第二性征,促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和組織的修復(fù)。在體內(nèi)睪酮以結(jié)合和游離兩種狀態(tài)存在,大約60%的睪酮與性激素結(jié)合球蛋白結(jié)合,其余與白蛋白結(jié)合,而只有1% ~2%處于游離狀態(tài)。除游離睪酮外,與白蛋白結(jié)合的睪酮也可能具有生物活性,而性激素結(jié)合球蛋白則能夠抑制睪酮的活性。有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間力竭性運(yùn)動(dòng)甚至可以使男運(yùn)動(dòng)員的血睪酮降至正常女性水平[6]。一次運(yùn)動(dòng)引起的血睪酮濃度下降可以很快恢復(fù),一般為幾個(gè)小時(shí)或幾天。但如果長(zhǎng)期高強(qiáng)度訓(xùn)練,血睪酮較難恢復(fù)。因此,低睪酮水平與運(yùn)動(dòng)性疲勞狀態(tài)相關(guān)。最新的一項(xiàng)研究,表明在健康老年男性中,低游離睪酮水平提示體質(zhì)比較脆弱[7]。本研究結(jié)果中慢性應(yīng)激可以使大鼠體內(nèi)睪酮水平的降低達(dá)到中樞性運(yùn)動(dòng)性時(shí)的水平。提示慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠長(zhǎng)時(shí)間處于軀體疲勞狀態(tài),并可能導(dǎo)致體質(zhì)的下降。

      本研究中不可預(yù)測(cè)慢性應(yīng)激使大鼠的睪酮水平降低的原因可能為,在慢性應(yīng)激條件下大鼠下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能應(yīng)激性亢進(jìn)與下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸功能應(yīng)激降低密切相關(guān)。應(yīng)激反應(yīng)時(shí),下丘腦促腎上腺皮質(zhì)釋放激素(CRF)及腎上腺糖皮質(zhì)激素(GCS)大量釋放,CRF和 GCS均可在下丘腦、垂體、性腺(睪丸或卵巢)多水平抑制 HPG軸功能[8-11]。最近研究發(fā)現(xiàn),在加速衰老的大鼠模型中,其體內(nèi)睪酮水平明顯降低,同時(shí)反映其活力指標(biāo)的不活動(dòng)的時(shí)間出現(xiàn)了明顯的延長(zhǎng)[12]。52%的惡性腫瘤患者具有中-重度疲勞感,其中42.4%的女性和65.5%的男性脫氫表雄酮的水平偏低[13]這些證據(jù)說明睪酮水平與疲勞感之間存在著密切的關(guān)系。

      到目前,雖然慢性疲勞綜合征病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明,但普遍認(rèn)為其發(fā)病與長(zhǎng)期應(yīng)激相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)慢性應(yīng)激導(dǎo)致疲勞狀態(tài)時(shí),其體內(nèi)睪酮水平降低,這種改變以游離睪酮與總睪酮比值的形式變化最直接和可靠,能夠最大限度的避免個(gè)體差異。如我們將這一檢測(cè)手段用來研究長(zhǎng)期處于高度應(yīng)激狀況下人群的睪酮水平變化,則有可能尋找到診斷慢性疲勞綜合征的生物化學(xué)指標(biāo)。

      (致謝:清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)工程研究所洪波老師,梁惠施同學(xué);首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院李宇航老師;首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部喬欣老師在本研究中給予了大量幫助,在此表示真誠的感謝!)

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      Testosterone Level Decreases in Chronic Stress Rats

      LIU Zhan-dong1,BAO Xiao-li2,ZHANG Jin-lu3,LIU Tian-h(huán)ui2,ZHAO Huan-ying3,ZHAO Jun-peng3,CHEN Jun1,ZHAO Yuan1,ZHAO Hong1,WANG De-xin1
      (1.Department of Neurology;2.Liver Research Center,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China;3.Beijing Institute for Neuroscience,Capital Medical University,Beijing,100067)

      ObjectiveTo investigate the serum testosterone variation and its relevance to fatigue by a comparison of the serum testosterone levels in chronic stress rat model and athletic fatigue rat model.MethodsTo establish a chronic stress rat model and an athletic fatigue model,to monitor the rat activity capacity with a rat movement tracing device and to detect the serum total testosterone(TT)level and serous free testosterone(FT)level using radio-immunological methods.ResultsThe total activity capacity(referring to the length of rat movement track)of chronic stress rats increased(P<0.01)compared with control in the first week.However,the chronic stress rats had lower total activity capacity than the control group(P<0.01).The serum free testosterone(FT)level was linearly correlated with the total testosterone level in all groups.With the prolongation of stress,the FT/TT ratio in four week chronic stress group decreased to the same level in the athletic group.ConclusionChronic stress caused significant decrease in rat serum testosterone level,suggesting that it is applicable to quantify the biochemical parameters for the diagnosis of chronic fatigue syndrome(CFS)with dynamic tracing method and stratified evaluation of serum FT and TT in CFS patients.The FT/TT ratio proves to be a relaible indicator of male hormones,and may well reflect the physiological influence of interventional factors.

      Chronic stress;Fatigue;Testosterone;Chronic fatigue syndrome;Rat

      R872.7

      A

      1005-4847(2010)06-0526-04

      10.3969/j.issn.1005-4847.2010.06.017

      2010-05-10

      首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床合作課題 (編號(hào):10JL33)。

      劉占東(1971-),男,醫(yī)學(xué)博士,副主任醫(yī)師。研究方向:神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病的神經(jīng)生物化學(xué)領(lǐng)域,對(duì)于慢性疲勞綜合征有較為深入的研究。E-mail:Zhandongliu@hotmail.com

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