馮志霞, 張培旭, 陳嘉峰, 李 巖, 桂明玉, 李緒文, 姜二晨, 金永日

人參皂苷是人參中的活性成分,目前已經(jīng)從人參根中提取出 40余種[1]人參皂苷單體,按皂苷元母核的結(jié)構(gòu)可分為齊墩果酸類、原人參二醇類、原人參三醇類。至今為止,關(guān)于二醇組人參皂苷如人參皂苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2以及三醇組人參皂苷如人參皂苷 Rg1、Rg2、Re等的研究較多。研究結(jié)果表明,人參皂苷具有很多藥理作用,如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、改善學(xué)習(xí)記憶、降脂降糖、擴張血管、保護心肌細胞、清除自由基、抑制鈣超載、抑制細胞凋亡、減輕興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的毒性作用等[2～5]。F組人參皂苷是由人參皂苷 F1、F2、F3、F5、Fe等組成的混合物。研究表明,人參皂苷 F1對血管性癡呆、阿爾茨海默病、骨性關(guān)節(jié)炎、缺血性心臟病、白內(nèi)障、再生障礙性貧血、帕金森病具有治療作用。但至今為止關(guān)于 F組人參皂苷對缺血性腦血管病的作用及機制的研究鮮見報道。

本實驗旨在對 F組人參皂苷在腦缺血中的作用進行動物實驗研究,為 F組人參皂苷的臨床應(yīng)用提供實驗學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 選用健康雄性 Wistar大鼠 70只,2～3月齡,體重 250～300g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物室提供。隨機分為 5組：A假手術(shù)組、B鹽水對照組、C小劑量給藥組、D中劑量給藥組、E大劑量給藥組,每組 14只。C、D、E組分別于術(shù)前30min及術(shù)后 30min、3h給予不同劑量的 F組人參皂苷腹腔內(nèi)注射。小劑量組(10mg/kg)、中劑量組(15mg/kg)、大劑量組(20mg/kg),鹽水對照組則在相同時間給予與 E組等體積的生理鹽水腹腔注射。

1.2 動物模型制備 參照 Zea Longa線栓法[6]制作右側(cè)大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。大鼠用 10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)及頸外動脈,結(jié)扎頸外動脈,近心端距離分叉1.5 cm處結(jié)扎頸總動脈。在頸總動脈距離分叉處0.5cm處剪一小口,插入直徑為 0.26mm的尼龍線,進線長度約 1.8cm±0.05cm,阻斷右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)的血流。假手術(shù)組進線長度為 1.2cm,其他操作與手術(shù)組相同。術(shù)后 2h動物完全清醒后參考 Longa法進行神經(jīng)功能評分,將評分在 1～3分之間的動物納入實驗,Longa評分法：0分,無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀,活動正常;1分,不能完全伸展左側(cè)前爪;2分,爬行時出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈;3分,行走時身體向左側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走、意識水平下降。如有死亡的大鼠,取同批次大鼠補足。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 腦梗死體積的測定 每組取 6只大鼠于術(shù)后 24h斷頭取腦,將腦組織放入 -20℃冰箱中冷凍,自額極向后冠狀面切成 2mm厚的切片,放入2%TTC溶液中,嚴格避光,37℃恒溫孵育,30min后移置 4%多聚甲醛中固定,正常組織被染成紅色,無染色區(qū)為梗死組織。數(shù)碼相機拍照后,應(yīng)用 Imagine-pro p lus 6.0圖像分析軟件測量腦梗死面積,再按照V=(A1+A2+…+An)t/2的公式計算出梗死體積。t為切片厚度,A為梗死面積。

1.3.2 腦組織 HE染色標(biāo)本的制備及觀察各組取 4只大鼠分別于術(shù)后 24h麻醉,打開胸腔,完全暴露心臟,由左心室插入 20號針頭,剪開右心耳,依次用生理鹽水及4%多聚甲醛各 200ml灌注固定,灌注后斷頭取腦,放入新鮮配制的 4%多聚甲醛中固定 24h。常規(guī)乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,包埋后組織塊連續(xù)冠狀切片,片厚約 7μm,HE染色后,光鏡下觀察并攝片。

1.3.3 TUNEL染色方法及觀察 各組取 4只大鼠,灌注及固定方法同前,固定后的腦從前到后切成 2mm厚的腦片 5片,取中間一片進行石蠟包埋。包埋后組織塊連續(xù)冠狀切片,片厚約 7μm,取 2張切片按試劑盒說明進行 TUNEL染色。凋亡細胞計數(shù)時,每張切片在高倍鏡下(40×)于缺血側(cè)額頂皮質(zhì)及海馬區(qū)分別隨機采集 5個視野,計數(shù)每個視野的凋亡細胞個數(shù),計算其平均值。

1.3.4 VEGF免疫組化染色方法及觀察 各組取 4只大鼠,灌注取腦及切片方法同前,用 SP法進行免疫組化染色,每張切片于缺血側(cè)隨機選擇 5個視野計數(shù)陽性細胞數(shù),取其平均值代表大鼠VEGF的陽性表達程度。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠局灶性腦缺血后梗死灶的大小 存活大鼠于術(shù)后 24h斷頭取腦,發(fā)現(xiàn)梗死側(cè)大腦半球水腫明顯,體積明顯大于對側(cè)。TTC染色顯示,與鹽水對照組大鼠相比,給藥組大鼠梗死體積均有顯著減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。但大中小劑量給藥組之間的梗死體積無明顯差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠缺血 24h后梗死灶體積的比較

2.2 HE染色觀察 鹽水對照組皮層缺血區(qū)可見大片腦組織壞死,神經(jīng)元脫失,局部區(qū)域可見有出血灶,血管腔隙增大,管腔內(nèi)可見成簇的紅細胞。神經(jīng)元呈現(xiàn)不同程度的缺血性改變：腫脹的神經(jīng)元胞漿淡染,呈圓形或者橢圓形;殘存的神經(jīng)元胞體小,胞核固縮呈三角形,核仁消失。由于出現(xiàn)了廣泛水腫,在制成病理切片過程中水分脫失,導(dǎo)致視野內(nèi)可見到大量的空泡樣變,類似海綿狀。藥物治療組大鼠腦缺血范圍小,梗死邊緣組織結(jié)構(gòu)未完全破壞,缺血區(qū)殘存神經(jīng)元較多,空泡樣改變程度較輕(見圖1、圖2)。

2.3 TUNEL染色 鹽水對照組缺血側(cè)大腦半球皮層、海馬區(qū)、基底節(jié)區(qū)可見凋亡細胞,缺血中心區(qū)呈散在分布,缺血邊緣區(qū)內(nèi)側(cè)成簇分布,陽性細胞核呈棕黃色,胞質(zhì)均質(zhì)濃縮,胞核深染,輪廓清晰,細胞體積小,邊集于核周呈新月形或環(huán)形,并且可見少量大小不等深染成棕黃色的圓形小體,形似凋亡小體。給藥組在缺血側(cè)缺血中心區(qū)及缺血周圍區(qū)亦可檢測到凋亡細胞,呈散在分布,形態(tài)與鹽水對照組相似,數(shù)量顯著少于對照組(P＜0.05)。3個劑量組之間也存在統(tǒng)計學(xué)意義,隨著給藥劑量的增加,凋亡細胞數(shù)目減少(P＜0.01)(見表2、見圖3～圖7)。

2.4 VEGF免疫組化染色 VEGF在假手術(shù)組即有少量的陽性表達,主要分布于皮層、海馬和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)。陽性著染細胞主要為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞,表達于核周胞漿和主樹突,胞核為陰性表達。鹽水對照組,VEGF陽性著染細胞數(shù)目增多。藥物治療組,在缺血后 24h陽性著染細胞數(shù)均高于對照組的表達數(shù)目(P＜0.01),3個劑量組之間的差異也存在統(tǒng)計學(xué)意義,隨劑量增加,陽性表達細胞數(shù)增加(P＜0.01)(見表3、見圖8、圖9)。

表2 各組大鼠缺血 24h后凋亡細胞數(shù)的比較(±s)

表2 各組大鼠缺血 24h后凋亡細胞數(shù)的比較(±s)

注：HP表示 40×10倍視野

組別 樣本數(shù) 劑量(mg/kg)凋亡細胞數(shù)(個/HP)假手術(shù)組鹽水對照組小劑量組中劑量組大劑量組4 4 4 4 4 10 15 20 0 27.15±2.84 19.45±0.53 14.85±0.34 10.90±0.53

3 討 論

細胞凋亡是細胞的程序性死亡,在腦缺血中神經(jīng)元死亡包括壞死和凋亡兩種方式,缺血核心區(qū)以壞死為主,而半暗帶內(nèi)的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡則以凋亡為主[7]。腦缺血后,能量代謝障礙,糖酵解增加,產(chǎn)生大量乳酸,使細胞內(nèi) H+濃度增加,激活 Na+/H+交換體,排出細胞內(nèi)多余的 H+以維持 pH正常,導(dǎo)致細胞內(nèi) Na+超載,引起 Na+/Ca2+交換增強,后者導(dǎo)致鈣超載。鈣超載與細胞凋亡密切相關(guān),被認為是導(dǎo)致細胞凋亡的最后通路。鈣超載參與神經(jīng)元凋亡的機制目前尚不清楚,可能與以下因素有關(guān)：(1)鈣超載破壞了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能,使細胞能量代謝受阻,ATP生成減少;(2)鈣超載發(fā)生于細胞核,激活 Ca2+-Mg2+依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶,使DNA降解成 185～200bp核小體單位的 DNA片段,導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡;(3)鈣超載促進自由基的生成從而導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡;(4)鈣超載激活蛋白激酶 C(PKC),PKC通過多種途徑引起神經(jīng)元凋亡,如激活磷脂酶促進自由基生成、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB),導(dǎo)致其活化,使血管收縮,加重缺血缺氧等。

興奮性氨基酸(EAA)主要通過鈣超載介導(dǎo)細胞損傷。 EAA激活 N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA)受體使鈣通道病理性開放,引起鈣超載;EAA也可激活代謝型紅藻氨基酸/a-氨基-3羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(KA/AMPA)受體促進 Na+內(nèi)流和 K+、Cl-外流,細胞膜持續(xù)去極化,進而啟動電壓依賴性鈣通道開放,進一步加重鈣超載。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),F組人參皂苷能阻滯神經(jīng)元的電壓依賴性 Ca2+通道、減少鈣通道介導(dǎo)的細胞凋亡、減輕興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的毒性作用。本實驗結(jié)果證明,與鹽水對照組相比,藥物組的細胞凋亡數(shù)目減少(P＜0.05),梗死體積減小,且隨劑量的增加凋亡細胞減少更加明顯(P＜0.05)。

VEGF能特異性地直接作用于血管內(nèi)皮細胞,是促進新生血管形成的重要細胞因子,Jin[8]等研究發(fā)現(xiàn)缺氧是誘導(dǎo) VEGF及其受體表達的主要因素,可提高 VEGF及 VEGFR的 mRNA表達、蛋白合成和生物活性,VEGF具有減少腦損害,促進新生血管形成、保護神經(jīng)及促進缺血后神經(jīng)元再生的功能。本實驗證明,與鹽水對照組比較,F組人參皂苷能促進VEGF表達上調(diào)(P＜0.01),其表達隨著給藥劑量的增加而增多(P＜0.01)。

本實驗證明 F組人參皂苷能縮小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死體積,減少細胞凋亡,促進 VEGF表達增加,F組人參皂苷對腦缺血損傷具有保護作用,為其用于缺血性腦血管病的治療提供了實驗學(xué)證據(jù)。

圖1 鹽水對照組腦缺血 24h梗死灶周圍區(qū)病理改變(HE)40×

圖2 大劑量給藥組腦缺血 24h梗死灶 周圍區(qū)病理改變(HE)40×

圖3 假手術(shù)組在缺血 24h后 TUNEL檢測凋亡細胞 40×

圖4 對照組在缺血 24h后TUNEL檢測凋亡細胞 40×

圖5 小劑量給藥組在缺血 24h后 TUNEL檢測凋亡細胞 40×

圖6 中劑量給藥組在缺血 24h后 TUNEL檢測凋亡細胞 40×

圖7 大劑量給藥組在缺血 24h后TUNEL檢測凋亡細胞 40×

圖8 鹽水對照組在缺血 24h后 VEGF表達 40×

圖9 大劑量給藥組在缺血 24h后 VEGF表達 40×

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