RP-HPLC法測定柴胡中四種黃酮類成分的含量

岳志勁,關(guān)翠林,王海青,孟雙明,郭 永

(山西大同大學化學與化工學院,山西大同037009)

RP-HPLC法測定柴胡中四種黃酮類成分的含量

岳志勁,關(guān)翠林,王海青,孟雙明,郭 永

(山西大同大學化學與化工學院,山西大同037009)

建立反相高效液相色譜法測定柴胡中蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種黃酮類成分的含量.采用Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)分離樣品，以0.5%的磷酸溶液-甲醇(63:37)為流動相，流速為0.8 mL·min-1，檢測波長333 nm，柱溫40℃，進樣量20 μL.結(jié)果顯示柴胡中四種黃酮類藥物達到了完全分離，線性范圍1～10 μg，平均回收率在91.2%～96.3%之間，RSD分別為為1.6%，2.1%，3.0%和1.1%(n=3).

柴胡 蘆丁 曲克蘆丁 黃芩苷槲皮素 反相高效液相色譜

柴胡屬傘形科植物，多年生草本，以根及全草入藥，是我國大宗緊缺藥材之一.它味苦、辛，性平，具有和解表里、舒肺解郁、升舉陽氣的功能，主治疏散退熱、胸肋脹疼、月經(jīng)不調(diào)等癥[1].柴胡中的有效成分為柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油(柴胡醇、丁香酚等)、脂肪油(油酸、亞麻油酸、棕櫚酸、硬脂酸等)和多糖等，此外，還含有生物堿、黃酮類、山萘苷、葡萄糖、氨基酸等.其中黃酮類化合物對人體腫瘤、衰老、心血管等疾病的治療和預(yù)防有重要意義[2].如蘆丁具有抗氧化、抗基因突變，和降低毛細血管異常通透性及脆性的作用[3],臨床上用于治療過敏性紫癜及各種因毛細血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治療高血壓和老年氣管炎等[4].曲克蘆丁是蘆丁在堿性條件下與環(huán)氧乙烷進行醚化反應(yīng)得到的羥乙基蘆丁的有效成分，能降低毛細血管的通透性和脆性，并有抑制血小板凝結(jié)，防止血栓形成的作用，是臨床上治療閉塞性腦血管病的常用藥物[5].黃芩苷具有清熱解毒，擴張心腦血管，改善體內(nèi)微循環(huán)等作用[6].槲皮素是黃酮類化合物中具有代表性的一種,研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并發(fā)癥等多種生物活性及藥理作用，對呼吸道疾病，特別是對哮喘病和支氣管疾病有較好的作用[7].

目前已報道的測定黃酮類藥物的方法很多，主要有化學發(fā)光分析法[8]、毛細管電泳法[9]、高效液相

色譜法[10-11]、分光光度法[12]、等吸收紫外光度法[4]等，但一般都是分析一種或兩種黃酮類成分，同時分析蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種成分還未見報道.本文采用反相高效液相色譜法，同時分離和測定了柴胡中蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷和槲皮素四種黃酮類成分的含量.操作方法簡單易行，結(jié)果準確可靠，為柴胡中黃酮類成分的含量測定和質(zhì)量監(jiān)控提供了科學依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

日本島津 (SHIMADZU)LC-10A高效液相色譜儀系統(tǒng)；CLASS-VP色譜工作站；Milli-Q純水器(Millipore公司)；HANGPING SB2200電子天平 (上海天平儀器廠)；0.45 μm微孔過濾器；高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器廠).

蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200306)；曲克蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100416-200503)；黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110715-200514)；槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406)；柴胡 (產(chǎn)地：河北祁州，生產(chǎn)廠家：河北安國興旺制藥飲片公司).甲醇、乙腈為色譜純，水為Milli-Q純水器處理的超純水，其它試劑為分析純.

1.2 實驗方法與結(jié)果

1.2.1 對照品溶液的制備

稱取蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素對照品各10 mg于四支比色管中,用甲醇溶解并定容至10mL，配制成濃度為1 mg·mL-1的標準溶液.取上述標準溶液各100 μL于一支10 mL比色管中，然后用甲醇定容至刻度，配制成濃度為0.01 mg·mL-1的標準混合溶液.測定時取上述標準溶液稀釋成適宜濃度的標準溶液.

1.2.2 供試品溶液的制備

柴胡用粉碎機粉碎后，過4號篩，稱取5 g置于圓底燒瓶中，加70 mL乙醇和30 mL水回流2.5 h.待冷卻、過濾后，于78℃蒸餾回收乙醇.浸膏用水飽和的乙酸乙酯萃取3次(20:15:10)，合并乙酸乙酯層，于77℃蒸餾回收乙酸乙酯.殘渣用甲醇定容至10 mL比色管中，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液再用0.45 μm微孔濾膜過濾即得.

1.2.3 色譜條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS柱 (150 mm×4.6mm，5 μm)；保護柱：Shim-packGVP-ODS柱(4.6 mm×10 mm，5 μm)；流動相：0.5%的磷酸溶液-甲醇 (63:37)；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：333 nm；進樣量：20 μL；柱溫：40℃.對照品和樣品的色譜圖見圖1.

1.2.4 線性關(guān)系考察

取適宜濃度的標準溶液，用甲醇稀釋并定容于10 mL比色管中，配制濃度分別為10 μg·mL-1，5μg·mL-1，2.5 μg·mL-1和1 μg·mL-14個水平黃酮類藥物的標準混合液，每個溶液分別進樣3次，以峰面積對濃度作工作曲線，用稀釋法測定四種黃酮類藥物的檢出限.四種黃酮類藥物的標準工作曲線線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表1，其中X表示黃酮類藥物的濃度，Y表示黃酮類藥物的峰面積.

圖1 對照品(A)和柴胡藥材(B)的高效液相色譜圖

表1 四種黃酮類藥物的回歸分析結(jié)果及線性范圍

1.2.5 穩(wěn)定性試驗

稱取柴胡樣品5 g，按1.1.2法操作制備供試品溶液，分別在1，2，3，4 d于上述色譜條件下測定，以峰面積計算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為2.1%，2.2%，3.5%，4.7%.結(jié)果顯示供試品溶液在4 d內(nèi)穩(wěn)定.

1.2.6 重復(fù)性試驗

稱取柴胡樣品5 g共6份，按1.1.2法操作制備供試品溶液，于上述色譜條件下測定，以峰面積計算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.1%，3.5%，2.7%，4.3%.

1.2.7 精密度考察

取上述對照品溶液20 μL，按照上述色譜條件重復(fù)進樣6次，以峰面積計算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.6%，2.1%，3.0%，1.1%..

1.2.8 回收率測定

取已知含量的柴胡供試品溶液各1 mL分別于三支10 mL比色管中，再分別加入4 μL，6 μL，8μL的1 mg·mL-1蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷，(槲皮素因含量較高，標準品加入量增加10倍)，配制成4 μg·mL-1，6 μg·mL-1，8 μg·mL-1的加標溶液.在最佳色譜條件下進樣，做加標回收試驗，回收率見表2.

表2 柴胡中黃酮類藥物的回收率(n=3)

1.2.9 樣品測定

將柴胡供試品溶液直接進樣分析，發(fā)現(xiàn)柴胡中槲皮素含量較高，故采用單點校正法定量，其它三種組分含量較低，采用標準加入法定量，樣品測定結(jié)果見表3.

表3 樣品中四種黃酮類成分含量測定(n=3)

2 討論

2.1 流動相的選擇

考察采用甲醇和水、甲醇和磷酸或磷酸鹽、乙腈和磷酸、四氫呋喃(THF)和磷酸五種不同體系作為流動相時蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種黃酮成分的分離情況，結(jié)果表明：采用CH3OHKH2PO4(40:60)為流動相時，黃芩苷和槲皮素拖尾比較嚴重；選擇H3PO4-CH3CN(54:46)為流動相時，各組分分離情況不佳；當用H3PO4-THF(67:33)為流動相時，雖然峰形比較好，但蘆丁和曲克蘆丁分不開；選擇CH3OH-H2O(37:63)為流動相時柱壓很高；而選用CH3OH-H3PO4(37:63)時，峰形好又可以使四個組分在35 min內(nèi)達到完全分離，而且柱壓也不高.綜合考慮以上因素，最后選CH3OH-H3PO4(37: 63)為分離四種黃酮類藥物的流動相.

2.2 流動相中甲醇比例的選擇

考察流動相中甲醇比例不同時，對四種黃酮組分保留時間的影響.以混合標準溶液進樣分析，結(jié)果顯示：隨著甲醇比例增加，流動相的極性增強，各組分的保留時間相應(yīng)縮短.當甲醇比例超過37%時，各峰的峰形不太好；當甲醇的比例小于37%時，流動相極性減弱，各組分的保留時間相應(yīng)增加，導(dǎo)致分析時間大大延長，且柱壓增大；當甲醇比例為37%時，在35 min內(nèi)四種組分達到基線分離.

2.3 檢測波長的選擇

取20 μL的0.01 mg·mL-1標準混合溶液進樣，由紫外光譜可知：蘆丁在350 nm和260 nm時有最大吸收；曲克蘆丁在354 nm和255 nm時有最大吸收；黃芩苷在318 nm和274 nm處有最大吸收；槲皮素在370 nm和254 nm處有最大吸收.結(jié)果顯示：當檢測波長小于333 nm時，溶劑峰較大，干擾大，影響測定的靈敏度；當檢測波長大于333 nm時，基線不穩(wěn)且黃芩苷的靈敏度較低.而在333 nm時，四種組分均有較靈敏的響應(yīng)，且干擾小，分離佳，便于檢測，因此選擇333 nm作為檢測波長.

本方法重復(fù)性、精密度好，回收率符合要求，測定結(jié)果準確，可以為柴胡藥材的質(zhì)量監(jiān)控提供實驗依據(jù).

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Abstract:To establish a method for determining Rutin,Troxerutin,Baicalin and Quercetin in Radixbupleurichinensis by RPHPLC.The analysis was performed on Shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm,5 μm)column with mobile phase contained phosphoric acid (0.5%)-methanol(63:37).The flow rate was 0.8 mL·min-1 and the detection wavelength was set at 333 nm.The temperature of column was 40℃and the injected volume was 20 μL.Under this condition,Rutin,Troxerutin,Baicalin and Quercetin could be completely separated.The lined range of four flavonoids was 1～10 μg,respectively.The average recovery of four flavoniods was 91.2%～96.3%,and the relative standard deviations of the method were 1.6%,2.1%,3.0%and 1.1%(n=3),respectively.The method is fast,simple,accurate and reliable which can be applied to the quality control of Radixbupleurichinensis.

Key words:Radixbupleurichinensis；Rutin；Troxerutin；Baicalin；Quercetin；RP-HPLC

〔編輯 楊德兵〕

RP-HPLC Determination of Four Flavonoids in Radixbupleurichinensis

YUE Zhi-jin，GUAN Cui-lin，WANG Hai-qing，MENG Shuang-ming,GUO Yong
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

R284.2

A

1674-0874(2010)04-0035-04

2010-05-03

山西大同大學科學研究項目[2008k6]

岳志勁(1971-)，女，山西大同人，碩士，講師，研究方向：分析化學.