鐘美明 （中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 山東青島 266000）

微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(simple tandem repeats,STRs)或簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSRs)，是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，所以被廣泛應(yīng)用于親子鑒定。RD Schnabel[1]等研究證實(shí)了利用12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)足以對(duì)北美野牛和家養(yǎng)牛進(jìn)行常規(guī)性的親權(quán)鑒定，被測(cè)群體中野牛bison排除率達(dá)到0.9955，cattle的排除率達(dá)到0.9995；V Rehout[2]等利用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)荷斯坦奶牛進(jìn)行親權(quán)鑒定，位點(diǎn)的雜合度最低0.607，最高0.835，多態(tài)信息含量最低0.575，最高0.816，10個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合排除率達(dá)到0.999；根據(jù)2004年9月11～16日在東京舉行的第29屆ISAG國(guó)際會(huì)議上，其中一篇文獻(xiàn)中提到，隨機(jī)抽取了58頭斯洛伐克荷斯坦牛的血液樣品，進(jìn)行11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)，聯(lián)合排除率達(dá)到0.999[3]。國(guó)內(nèi)在利用微衛(wèi)星進(jìn)行親子鑒定方面的研究也很多，例如高愛保等[4]利用多重PCR擴(kuò)展20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)涼山半細(xì)羊毛進(jìn)行親權(quán)鑒定，雙親未知時(shí)，累積排除率達(dá)到0.998666；在父系半同胞基礎(chǔ)上進(jìn)行母子親權(quán)鑒定，累積排除率達(dá)到0.999994；賈名威等[5]采用6個(gè)STR基因座對(duì)7頭奶牛進(jìn)行鑒定，父權(quán)概率達(dá)到0.99993；管峰等[6]應(yīng)用4個(gè)STR位點(diǎn)對(duì)2份凍精和4頭可疑種公牛進(jìn)行個(gè)體鑒定，鑒別能力達(dá)0.9999。除此之外，微衛(wèi)星標(biāo)記在兔、犬、虎和熊貓等動(dòng)物中都有非常廣泛的應(yīng)用[7-9]。

北美荷斯坦奶牛具有產(chǎn)奶量高、奶質(zhì)好等特點(diǎn)，引進(jìn)和繁育荷斯坦奶牛有利于提高中國(guó)奶品的質(zhì)量。準(zhǔn)確的系譜記錄對(duì)現(xiàn)代奶牛育種是十分重要的，但實(shí)際中有很多原因會(huì)導(dǎo)致系譜記錄錯(cuò)誤，例如精液編號(hào)錯(cuò)誤，混合精液授精，放牧方式飼養(yǎng)等。本試驗(yàn)中檢測(cè)的奶牛均屬于混合精液體外受精，因此對(duì)這些奶牛進(jìn)行親子鑒定檢測(cè)具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。本文通過(guò)檢測(cè)荷斯坦奶牛的15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性，旨在建立一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)荷斯坦奶牛的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)檢測(cè)的350頭奶牛是經(jīng)過(guò)體外受精，再胚胎移植到其他牛體內(nèi)發(fā)育的。卵細(xì)胞來(lái)自屠宰場(chǎng)的卵巢，35支精液屬于荷斯坦種公牛，體外授精時(shí)同時(shí)有3～4個(gè)父本存在。

1.2 主要試劑和儀器

試劑：10×PCR buffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶，引物，尿素，N，N-亞甲雙丙烯酰胺，丙烯酰胺，三羥基氨基甲烷（Tris），十二烷基磺酸鈉（SDS），去離子甲酰胺，四甲基乙二胺（TEMED）均來(lái)自上海生工，Marke為自制。

儀器：ABI PRISMTM377測(cè)序儀，PCR熱循環(huán)儀等

2 試驗(yàn)方法

2.1 DNA模板提取

2.1.1 血液DNA的提取 取100μl左右的全血，剪碎凝塊→加入全血DNA抽提液600ml及10mg/ml的蛋白酶K10μl，充分搖勻→在水浴鍋中56℃隔夜消化→加入500ml苯酚，振蕩30min→12000rpm離心10min→取上清，加入500ml苯酚，振蕩30min→12000rpm離心10min→吸上清，加入500ml氯仿，振蕩30min→12000rpm離心5min→吸上清，加入適量?jī)龃鏌o(wú)水乙醇，顛覆轉(zhuǎn)動(dòng)至DNA聚集成團(tuán)→除去上清→加入70%的乙醇清洗DNA→12000rpm離心2min→除上清，干燥30min→加入100μl左右TE，溶解，留作模板。

2.1.2 凍精DNA的提取 精液取100μl入1.5ml tube→12000rpm，10min→200μl PBS重懸→12000rpm離心10min→500μl SMB重懸→12000rpm離心5min→加入500μl SMB，10% SDS 12.5μl，蛋白酶K 5μl, 重懸精子細(xì)胞，震蕩混勻→37℃水浴過(guò)夜→500μl 苯酚氯仿異戊醇，12000rpm離心5min→移上清至新tube，加入500μl氯仿異戊醇，12000rpm離心5min→移上清至新tube→加入2M NaOAC 50μl和 500μl異 丙 醇 → –20℃ 3h→12000rpm 離 心15min→70% EtOH清洗沉淀→12000 rpm離心15min→55℃下用100μl 水溶

2.2 PCR反應(yīng)體系

15組引物分成5組進(jìn)行多重PCR，每對(duì)引物的反應(yīng)體系如下:10×PCRbuffer2.5μl，MgCl21.5μl，dNTP0.5μl，去離子水6μl，正反引物各1μl，TaqDNA聚合酶0.2μl。PCR擴(kuò)增程序：38 ℃ 2min ；95 ℃ 5min 預(yù)變性；94 ℃ 25min變性；55℃ 30min 退火；72℃ 45min延伸，循環(huán)35次；72 ℃ 2min最后延伸，分組情況見表1。

表1 復(fù)合PCR分組情況

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記與引物

微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇需要滿足以下條件[10]：（1）多態(tài)性高。具體體現(xiàn)在等位基因數(shù)目多，多態(tài)信息含量和雜合度值高。（2）沒(méi)有無(wú)效等位基因。（3）位點(diǎn)不連鎖。即位點(diǎn)要求不在同一條染色體上或者同一條染色體上的位點(diǎn)距離大于40cM。例如本試驗(yàn)中ETH225(8cM)和MM12(77cM)在同一染色體上，但距離超過(guò)40cM[11]。（4）已知等位基因長(zhǎng)度范圍。（5）適合多重PCR。

依照以上條件，并且根據(jù)ISAG(the Interneta-tional Society for Animal Genetics)推薦的位點(diǎn)和自選位點(diǎn)，經(jīng)試驗(yàn)最終確定15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中9個(gè)是ISAG推薦的核心位點(diǎn)組合(BM1824, BM2113, INRA023, SPS115, TGLA122,TGLA126, TGLA227, ETH10, ETH225)，引物序列見表2。

2.4 產(chǎn)物檢測(cè)及親權(quán)鑒定

本試驗(yàn)PCR產(chǎn)物變性后經(jīng)過(guò)ABI377測(cè)序儀電泳，得到的電泳圖像由GenescanV3.7.1和Genotyper分析后得到微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型，建立基因型數(shù)據(jù)庫(kù)。用Cervus2.0利用基因型數(shù)據(jù)庫(kù)，分析得到每一位點(diǎn)的等位基因頻率，雜合度的觀察值和期望值，多態(tài)信息含量(PIC)以及排除率，同時(shí)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡和無(wú)效等位基因頻率分析。

Cervus軟件的親權(quán)鑒定原理[12]是將候選父的基因型與子代基因型比較，如果在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)不匹配那就排除，剩余不能排除的候選父再通過(guò)似然比確定。似然分析以一個(gè)數(shù)據(jù)為起點(diǎn)，評(píng)估給出這個(gè)數(shù)據(jù)的假設(shè)。似然值(likelihood)L在假設(shè)條件H下給出數(shù)據(jù)D，記作L(H│D)。似然值往往是與另一個(gè)似然值相比較的情況下給出的，即似然比L(H1,H2|D)=P(D|H1)/ P(D|H2)，P(D|H)表示在H假設(shè)下得到數(shù)據(jù)D的概率，P(D|H1)一般指假設(shè)父是真正父的概率，P(D|H2)一般指假設(shè)父不是真正父的概率。

表2 各位點(diǎn)的染色體位置和引物序列

母本基因型不知道的情況下，似然比公式：L(H1,H2|ga,go)=T(go|ga)*p(ga)/P(go)*p(ga)=T(go|ga)/P(go),T(go|ga)：根據(jù)假設(shè)父得到的子代基因型頻率，P(go)：子代基因型頻率

一個(gè)大的似然比表示候選父是真正父比不是真正父的可能行更大。似然比是針對(duì)單個(gè)位點(diǎn)的，所有位點(diǎn)結(jié)合起來(lái)總的似然比相乘，取以e為底的對(duì)數(shù)就得到了LOD值。將LOD>0的值按從大到小排序，其中最大的LOD1，其次LOD2，Delta=LOD1-LOD2，即比較most-likely與second-likely候選父之間的LOD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

2.5.1 平均排除率 將所有位點(diǎn)的排除率通過(guò)基因型頻率加權(quán)得到總的平均排除率。與以似然值為基礎(chǔ)的親權(quán)鑒定方法沒(méi)有太大關(guān)系，尤其當(dāng)錯(cuò)誤率大于0時(shí)，但是可用來(lái)與前人或發(fā)表文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)作比較。

2.5.2 可信度檢驗(yàn) LOD或Delta不能用標(biāo)準(zhǔn)的卡方分布來(lái)檢驗(yàn)，所以Cervus用親權(quán)模擬(simulation)來(lái)評(píng)估可信度。模擬的目的是通過(guò)比較大量隨機(jī)后代的LOD，得到大量的Delta分布(模擬10,000次)。通過(guò)比較最可能父(most-likely parent)是真正父(true parent)時(shí)Delta分布與最可能父不是真正父時(shí)Delta分布，得到Delta關(guān)鍵值，假如這個(gè)關(guān)鍵值是在特定可信度水平如95%確定的，那么當(dāng)分析真實(shí)數(shù)據(jù)的親權(quán)關(guān)系時(shí)，最可能父的Delta值超過(guò)Delta關(guān)鍵值，其親權(quán)鑒定的可信度即為可信度95%。

3 結(jié)果和討論

3.1 Hardy-Weinberg平衡

Cervus檢測(cè)結(jié)果顯示，除INRA043和ILSTS006外，其他位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡。Cervus中指出一兩個(gè)位點(diǎn)的H-W不平衡并不影響似然比的計(jì)算，大量的不平衡就可能影響結(jié)果。INRA043和ILSTS006不平衡的原因不是因?yàn)榉中湾e(cuò)誤或無(wú)效等位基因，而是因?yàn)槿后w繁育的父本局限在35頭荷斯坦種公牛，因此可能造成了某些基因的頻繁出現(xiàn)。這種情況下仍可以用Cervus軟件分析親權(quán)關(guān)系，但是應(yīng)注意結(jié)果的可信度。

3.2 雜合度和多態(tài)信息含量

雜合度和多態(tài)信息含量結(jié)果見表3。雜合度的觀察值最小為0.377(SPS115)，最大為0.852(TGLA227)，平均為0.612；雜合度的期望值最小為0.362(SPS115)，最大為0.827(TGLA227)，雜合度觀察值的平均值為0.681。雜合度的期望值和觀察值的最小差值為0.002(INRA023)，最大差值為0.074(CSSM136)。差值小于0.2的位點(diǎn)有6個(gè)，差值在0.2～0.3之間的位點(diǎn)有4個(gè)，差值在0.3～0.5的位點(diǎn)有2個(gè)，差值在0.5～0.6的位點(diǎn)有2個(gè)。大部分位點(diǎn)的雜合度的觀察值和期望值差異較小，說(shuō)明等位基因分布比較合理。

多態(tài)信息含量在0.345-0.804之間變動(dòng)，平均值為0.639。當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，當(dāng)0.250.5的位點(diǎn)有12個(gè)，占到總位點(diǎn)數(shù)的80%；其余3個(gè)位點(diǎn)為中度多態(tài)性位點(diǎn)，這表明15個(gè)位點(diǎn)均具有高度的多態(tài)性，能夠提供豐富的位點(diǎn)信息。

3.3 排除率

Excl(1)即排除率1，是指當(dāng)父母雙方均未知的情況下位點(diǎn)的排除率；Excl(2)即排除率2，指當(dāng)父母一方已知的情況下位點(diǎn)的排除率，所有位點(diǎn)的平均排除率是各個(gè)位點(diǎn)的排除率通過(guò)基因型頻率加權(quán)的方法計(jì)算所得。通過(guò)計(jì)算得出當(dāng)父母雙方均未知的情況下，15個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合排除率為0.995492，當(dāng)父母一方已知的情況下，15個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合排除率為0.999936，因此這15個(gè)位點(diǎn)具有極高的排除率，足夠用于holstein奶牛的檢測(cè)。但是為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，當(dāng)子代和候選父有2個(gè)或2個(gè)以上位點(diǎn)不同時(shí)，排除其親緣關(guān)系。各個(gè)位點(diǎn)的排除率見表3。

表3 15個(gè)位點(diǎn)的雜合度、多態(tài)信息含量、排除率和Hardy-Weinberg平衡

3.4 鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)采用Cervus使用的似然值為基礎(chǔ)檢測(cè)親子關(guān)系，不能用標(biāo)準(zhǔn)的卡方分布來(lái)檢驗(yàn)，因此采用模擬(simulation)。分析結(jié)果中Delta最小值0.027，最大值7.19，LOD最小值0.0014，最大值9.7038，LOD值越大越可能是親生父。最終289頭被測(cè)小牛找到了親生父，可信度達(dá)到95%，并且位點(diǎn)能完全匹配。但因?yàn)槿后w取樣的局限性，造成其余61頭雖然能找到完全匹配的候選父，但可信度達(dá)不到95%。所以為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，只有所有位點(diǎn)匹配才能確認(rèn)親子關(guān)系，兩個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)以上的不匹配的排除親子關(guān)系。

4 結(jié)論

在胚胎移植過(guò)程中容易因冷配產(chǎn)生奶牛和其他種群牛的雜交種，實(shí)際檢測(cè)中荷斯坦奶牛與非荷斯坦奶牛的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列具有非常明顯的差異(本文中未顯示)，因此這15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記足夠進(jìn)行日常的荷斯坦奶牛的檢測(cè)。微衛(wèi)星標(biāo)記方法對(duì)于大批量親子鑒定檢測(cè)具有快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于未來(lái)國(guó)內(nèi)發(fā)展大規(guī)模規(guī)?；B(yǎng)殖和繁育具有很重要的意義。

本試驗(yàn)的目的在于分析荷斯坦奶牛15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，并以此為基礎(chǔ)建立起快速準(zhǔn)確的鑒定荷斯坦奶牛的方法。

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