劉 玲 管鳳霞 黎 敏 宋永峰 高 恒 梁思陽(yáng) 溫納相（廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司 新興 527400）

雞支原體屬原核生物，無細(xì)胞壁，由細(xì)胞膜包裹［1］。迄今為止確認(rèn)對(duì)雞致病的支原體有4 種, 包括引起雞慢性呼吸道病和火雞傳染性竇炎的禽雞毒支原體(MG)，引起雞和火雞亞臨床或臨床感染的滑液囊支原體(MS)，引起火雞氣囊炎的火雞支原體和衣阿華支原體(MI)［2］。

MG可引起家禽慢性呼吸道病(CRD)，本病流行于世界各國(guó)，是當(dāng)前冬春季節(jié)影響禽類生產(chǎn)的常見疾病之一。其特征性的癥狀是呼吸啰音、咳嗽、氣管炎、氣囊炎、流眼淚等。MG除引起呼吸道疾病癥狀外，還導(dǎo)致雛雞成活率低，生長(zhǎng)遲緩，增重減慢，飼料轉(zhuǎn)換率降低，肉雞屠宰率降低；MS感染主要引起家禽的滑膜炎、呼吸道癥狀,臨床表現(xiàn)為：冠蒼白、跛行、關(guān)節(jié)腫脹、輕度啰音、生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)蛋下降等［1］。

本研究從廣東某雞場(chǎng)送檢的疑似支原體感染病料中分離、培養(yǎng)獲得了2株支原體，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自廣東新興某雞場(chǎng)的病雞，無菌取病雞下支氣管三叉部、肺臟等。

1.1.2 試劑 改良的 Frey 氏培養(yǎng)基購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司、支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株、抗原、陽(yáng)性血清，均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，Ex-Taq酶購(gòu)于大連寶生物工程公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、蒸汽滅菌器、PCR儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 支原體的初步分離 無菌操作：將下支氣管三叉部、氣囊、肺等部位的組織，分別用2000IU/ml的青霉素漂洗3遍并剪碎成芝麻粒大小后，各種組織分別挑選3塊加入裝有1.8ml液體培養(yǎng)基的西林瓶中，蓋好膠塞。置37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察液體培養(yǎng)基顏色變化和混濁度，有雜菌生長(zhǎng)者棄之。每隔3d盲傳一代，要求至少傳三代，有顏色變化，注意及時(shí)調(diào)節(jié)pH值；若無顏色變化，繼續(xù)觀察15d后棄之。

1.2.2 分離物的純化 將變色后的液體培養(yǎng)基接種到固體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)8d，待菌落生長(zhǎng)后挑選單個(gè)菌落再接種到液體培養(yǎng)基中，連續(xù)重復(fù)3次，以取得純培養(yǎng)物。

1.2.3 分離物的形態(tài)觀察 取純培養(yǎng)物涂于載玻片上，姬姆薩染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.4 血清學(xué)診斷 平板凝集試驗(yàn)(SPA):取10ml純培養(yǎng)物以4000rpm 離心30min，棄上清，用0.5ml生理鹽水重懸菌體，作為抗原液。滴3滴抗原于載玻片上，每滴抗原依次加入等量的生理鹽水、標(biāo)準(zhǔn)MG抗血清、標(biāo)準(zhǔn)MS抗血清，充分混勻后，3min內(nèi)判定結(jié)果，液滴中出現(xiàn)明顯的粗大顆粒者為陽(yáng)性。并同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)的MG、MS陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 分子生物學(xué) 根據(jù)GenBank上公布的MG、MS序列，設(shè)計(jì)套式PCR引物見表1，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。套式PCR引物設(shè)計(jì)選取的基因片段及目標(biāo)片段大小見表2。取純培養(yǎng)物，提取DNA進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，凝膠電泳觀察結(jié)果。

表1 PCR引物

表2 PCR目標(biāo)片段

2 結(jié)果

2.1 初次分離及純化結(jié)果

初次分離，2個(gè)樣品接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d。培養(yǎng)基顏色變黃，盲傳及純化后，接固體平皿上增殖至第7天，在倒置顯微鏡下看到典型的“煎蛋”樣，具有一個(gè)致密中心的突起菌落(見圖1)。

圖1 支原體固體平板上的“煎蛋”樣菌×80

2.2 姬姆薩染色結(jié)果

姬姆薩染色后光鏡下可見菌體大多呈球點(diǎn)狀或鏈球狀，菌體被染成紫色，說明分離到2株支原體，分別命名為GX1和GX2。

2.3 血清學(xué)結(jié)果

在血清平板凝集試驗(yàn)中，MG抗血清能使分離株GX1發(fā)生凝集，MS抗血清能使分離株GX2發(fā)生凝集，2min內(nèi)形成明顯的粗大顆粒。平板凝集結(jié)果見表3，初步說明GX1株是MG，GX2株是MS。

2.4 套式PCR結(jié)果

將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：GX1株可以擴(kuò)增出約408bp的目的片段，即MG陽(yáng)性，；GX2株可以擴(kuò)增出688bp的目的片段，即MS陽(yáng)性（見圖2）。

表3 血清學(xué)結(jié)果

圖2 MG MS擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

此試驗(yàn)成功在本實(shí)驗(yàn)室建立支原體分離培養(yǎng)鑒定的方法，并根據(jù)培養(yǎng)特性觀察、血清學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果判定從病料分離到2 株支原體分離物，一株為雞毒支原體，另一株為滑液囊支原體，為以后開展該病的研究奠定了基礎(chǔ)。

由于支原體既可通過水平傳播，又可經(jīng)卵垂直傳播，從而導(dǎo)致雞群發(fā)生感染時(shí)很難將其徹底清除。目前檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法、電鏡法、血清學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法[3]，血清學(xué)方法由于常出現(xiàn)非特異性的交叉反應(yīng)而影響診斷的準(zhǔn)確性[4]，而分離培養(yǎng)由于支原體對(duì)所需條件要求苛刻，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，操作繁雜，不適應(yīng)現(xiàn)代集約化養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的需要[1]。PCR 法方法簡(jiǎn)單快速，敏感性遠(yuǎn)高于前兩種方法，可應(yīng)用于該病的早期診斷和檢疫，但技術(shù)條件要求較高，在檢測(cè)時(shí)常由于抑制劑的干擾等因素而可能出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)[5]，因此最終確診需要多種檢測(cè)方法聯(lián)合使用。

支原體所需培養(yǎng)條件高，生長(zhǎng)緩慢，不易分離得到。結(jié)合本次試驗(yàn)，對(duì)該技術(shù)的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)。據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道新鮮支氣管和肺組織中因雜菌污染少容易分離出雞毒支原體, 因此本試驗(yàn)取與肺相連的三叉氣管剪碎成芝麻粒放入改良的Frey氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離率明顯較其它器官提高。培養(yǎng)過程中，液體培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)調(diào)pH值一般直接滴加20%氫氧化鈉，但這樣對(duì)處于生長(zhǎng)期的病原應(yīng)激較大，建議滴加pH值10～12的培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)節(jié)。因致病性支原體在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)需3～10d才能形成菌落，而無致病性支原體，如雞支原體、家禽支原體1d內(nèi)就可能形成菌落，因此，2d內(nèi)形成的菌落，均可判為污染物棄之。醋酸鉈抑制真菌生長(zhǎng)，在分離培養(yǎng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，由于支原體生長(zhǎng)速度較慢，為防止初次分離時(shí)其它雜菌生長(zhǎng)消耗大部分營(yíng)養(yǎng)，影響支原體的正常增殖，所以初次分離培養(yǎng)時(shí)，醋酸鉈、青霉素必須用量加倍。

[1]Yoder, H. W., Jr. Mycoplasma gallisepticum infection. In：Disease of Poultry, 9 th ed. B. W. Calnek, H. J. Barnes, C. W. Beard, R. W. Reid and H. W. Yoder, Jr., eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa. In press.1991.212-231.

[2]邵國(guó)清. 我國(guó)主要?jiǎng)游镏гw病研究述略與展望[J].畜牧與獸醫(yī),2000, 32 (2) : 37-38.

[3] 段艷華,劉暢,宋海濤等.雞毒支原體的診斷與防治[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2007,2:60-61.

[4]陳鳳梅,牛鐘相,程光民等. 雞毒支原體研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004 , 25 (3) :56-59.

[5]劉利明,馮立志,胡登峰等. 雞毒支原體研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2005 , 32 (6) :61-62.

[6]林居純，曾振靈，向榮等.雞毒支原體的分離鑒定[J].養(yǎng)禽與禽病防,2007,8:21-22.