王曉丹 時(shí)曉明 曲顯俊 程艷娜 史桂云 高允生

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是繼發(fā)于各種原因引起的肝臟炎癥或損傷后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng),以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝內(nèi)過量沉積為病理特征[1]。近年的研究[2]表明肝星狀細(xì)胞(HSC)在肝纖維化的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用,HSC從靜止轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)可合成肝臟幾乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),同時(shí)合成大量 ECM,并通過其合成的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)調(diào)節(jié) ECM降解。為了研究 HSC在 ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促進(jìn) ECM降解的藥物,我們嘗試了 HSC明膠酶譜的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 明膠酶(gelatinase,17104-019,美國(guó) Gibco BRL公司產(chǎn)品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),過硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉雙丙烯酰胺(bisacrylamide)均為美國(guó) Bio.Basic.Inc.BBI公司產(chǎn)品 ;Triton X-100、SDS等,美國(guó)SERVA公司產(chǎn)品。其余試劑均為分析純。

1.2 試劑配制 1%明膠：稱 1.0 g明膠溶于 100 ml蒸餾水,37℃溶解,4℃保存。樣品緩沖液：0.25 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),10%SDS,4%蔗糖,0.1%溴酚藍(lán)。電泳緩沖液：0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸(pH 8.5),0.1%SDS。洗脫緩沖液：2.5%Triton X-100。明膠酶緩沖液：50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2。染色液：0.25%考馬斯亮藍(lán) R-250(溶于 1︰4.5︰ 4.5的冰乙酸、甲醇和 H2O中)。脫色液：冰乙酸︰甲醇︰ H2O=1︰ 4.5︰ 4.5。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HSC細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所生物檢測(cè)中心細(xì)胞庫(kù),生長(zhǎng)于 DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL,Rockville,MD,USA)+15%胎牛血清(含 2 mM L-glutamine,penicillin and streptomycin)中 ,置 37°C(5%CO2～ 95%air)培養(yǎng)箱生長(zhǎng),以0.05%EDTA-PBS分散成為單細(xì)胞。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 明膠酶的酶譜法測(cè)定

1.4.1 制膠 與普通的聚丙烯酰胺凝膠的制膠過程相同,只在分離膠中加入 1%的明膠,使明膠的終濃度為 0.1%。

1.4.2 樣品制備 HSC培養(yǎng) 24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基離心后以 2︰ 1與樣品緩沖液混勻,取 15μl上樣電泳。

1.4.3 電泳 于 BIO-RAD電泳槽中,常溫 80 V電壓電泳 30 min,100 V電壓電泳 1.5 h。

1.4.4 洗脫 將膠置于洗脫緩沖液中,脫色搖床上洗脫 15 min,蒸餾水中漂洗 3次,充分除去 SDS。

1.4.5 反應(yīng) 將膠置于反應(yīng)緩沖液中 37℃反應(yīng)過夜。

1.4.6 染色及脫色 將膠自反應(yīng)液中取出,三蒸水漂洗 2次,染色液中常溫染色 4 h,蒸餾水漂洗 2次,置脫色液中常溫脫色 15 min,照相、記錄。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)的 HSC 圖 1顯示培養(yǎng) 10d的 HSC,細(xì)胞呈星形、多邊形、棱形,有很長(zhǎng)的細(xì)胞突起。細(xì)胞復(fù)蘇以后傳代培養(yǎng),此時(shí)的 HSC是研究 ECM合成與降解的良好材料。

圖1 培養(yǎng) 10d的 HSC(×400)

2.2 酶譜法檢測(cè)到的 MMPs活性條帶 此方法能夠靈敏地檢測(cè)到 HSC分泌到細(xì)胞外的 MM--2和MMP-9,并且 MMP-2的活性高于 MMP-9(圖 2)。當(dāng)A3處理 24h以后,培養(yǎng)基中的 MMPs活性發(fā)生了改變,培養(yǎng)基中檢測(cè)到 MMP-9和 MMP-2并且 MMP-2活性增加(圖 3)。

圖2 酶譜法檢測(cè)到MMPs

圖3 A3處理 24h后 MMPs活性

3 討 論

肝纖維化是肝臟 ECM合成與分解代謝失衡所造成的不良結(jié)局,是臨床上常見的病理生理改變。HSC在肝纖維化的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用,既參與 ECM合成,也調(diào)節(jié)其降解,是造成 ECM在細(xì)胞外過度堆積的重要原因。酶譜法為研究 HSC MMPs基因表達(dá)差異,內(nèi)源及外源性激活條件,酶活性的調(diào)節(jié),從而研究肝纖維化的病理生理機(jī)制和研究具有促進(jìn)肝纖維化過程中 ECM降解的藥物和方法有重要意義。用含明膠的聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎(chǔ)的酶譜法,能夠檢測(cè)到 HSC細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的 MMP-2和 MMP-9,并且培養(yǎng)基中 MMP-2活性高于MMP-9,這與文獻(xiàn)報(bào)道的 HSC較高的表達(dá) MMP-2 mRNA相一致[3]。當(dāng)藥物作用后,培養(yǎng)基中 MMP-2顯著增加,表明 MMPs的表達(dá)發(fā)生了改變,或者酶被激活。目前,常用于檢測(cè) MMPs的方法主要是ELISA和放免法,這些方法只能檢測(cè)其含量,不能檢測(cè)其活性。而 MMPs活性受到 TIMPs調(diào)節(jié),TIMPs通過與 MMPs非共價(jià)結(jié)合,從而抑制 MMPs的活性和 ECM降解,MMPs的數(shù)量不反應(yīng)其對(duì) ECM的降解能力,因此,測(cè)定 MMPs活性更有意義[4]。酶譜法不影響 TIMPs與 MMPs的結(jié)合,能夠測(cè)定 MMPs的活性,反映其在 ECM降解過程中的作用,并且此方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。

[1] 高潤(rùn)平,齊曉艷.肝纖維化的發(fā)生機(jī)制與治療進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2006,14(23)：2263-2269.

[2] 趙穩(wěn)興,.梁崇禮.酶譜法測(cè)定肝星狀細(xì)胞合成的基質(zhì)金屬蛋白酶活性[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2002,18(2)：56-58.

[3] Lichtinghagen R,Breitenstein K,Arndt B,et al.Comparison of matrix metalloproteinase expression in normal and cirrhotic human liver[J].Virchows Arch,1998,432：153-158.

[4] Herron GS,Banda MJ,Clart E J,et al.Secretions of metelloproteinase by stimulated capillary endothelial cells[J].JBiol Chem,1986,261：2814-2818.