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      虎眼萬年青總皂苷中單體皂苷的分離純化

      2010-09-27 02:07:08娟,燮,
      關(guān)鍵詞:萬年青總皂苷柱層析

      孫 亞 娟, 金 鳳 燮, 魚 紅 閃

      ( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

      0 引 言

      虎眼萬年青(Ornithogalum caudatum Ait)是一種極具開發(fā)潛力的中草藥。虎眼萬年青中所包含的虎眼萬年青皂苷屬于甾體皂苷,甾體皂苷具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性,如抗腫瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等。虎眼萬年青皂苷OSW-1,是一種具有極強(qiáng)抗癌活性的酰基膽甾烷苷,對(duì)肺癌、乳腺癌有明顯的抗癌活性。體外抗p338淋巴細(xì)胞白血病活性結(jié)果表明,OSW-1是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10~100倍[1],而且對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性。迄今為止,國內(nèi)對(duì)虎眼萬年青的研究,主要集中在多糖的提取及藥理活性[2-4]和組織培養(yǎng)方向[5],對(duì)于虎眼萬年青皂苷的分離提取的報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)室肖沖等[6]已從虎眼萬年青中提取了虎眼萬年青皂苷,由于單體皂苷作用不同,所以有必要制成單體皂苷制劑。本實(shí)驗(yàn)以分離得到虎眼萬年青皂苷單體組分為首要目的,用硅膠柱層析法嘗試分離虎眼萬年青皂苷單體組分。

      1 材料與方法

      1.1 材料和儀器

      虎眼萬年青總皂苷,實(shí)驗(yàn)室自制;硅膠,青島海洋化工廠;薄層層析板(TLC),德國Merck公司生產(chǎn);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛郎儀器有限公司。

      1.2 方 法

      1.2.1 薄層層析(TLC)

      本實(shí)驗(yàn)所用薄層層析板由德國Merck公司生產(chǎn)。用微量取樣器取一定量樣品點(diǎn)于薄層層析板起始線上,電吹風(fēng)吹干,置于放好展開劑的展開缸中展開后,吹干溶劑,10% H2SO4溶液顯色,得TLC圖譜。所用展開劑為:V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7.0∶3.0∶0.5。

      1.2.2 減壓硅膠柱層析

      制備樣品膠:稱取一定量的虎眼萬年青總皂苷放入瓷碗中,加入適量的甲醇,充分溶解后,與1.5倍樣品質(zhì)量的80~100目硅膠混合,攪拌均勻,60 ℃水浴鍋上加熱,待樣品被硅膠吸附,溶劑充分揮發(fā)干燥后,磨成均勻的粉末,樣品膠制備完成。

      裝柱:先用一小塊脫脂棉堵住柱底,然后取16倍樣品質(zhì)量的300~400目硅膠(分離膠)裝柱,保持水平,抽真空壓實(shí),然后在其上面裝入薄薄一層80~100目的硅膠,再裝入干燥好的樣品膠,最后在樣品膠上面鋪上一層脫脂棉,抽真空壓實(shí)。

      硅膠柱裝好后,先用純氯仿通柱子,再用氯仿-甲醇的混合溶劑進(jìn)行洗脫,每次大約100 mL,分別收集洗脫液。用薄層層析法跟蹤檢測(cè)整個(gè)洗脫過程,根據(jù)硅膠板上顯示的結(jié)果,把具有相同組分的洗脫液收集在一起,濃縮得固體產(chǎn)物。

      本實(shí)驗(yàn)虎眼萬年青總皂苷用量為5 g,洗脫液比例為V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1。

      1.2.3 超高壓液相色譜檢測(cè)虎眼萬年青皂苷

      實(shí)驗(yàn)所用為美國Waters Acquity UPLC色譜儀;C18色譜柱為waters 50 mm×2.1 mm,1.7 μm;進(jìn)樣量為3 μL。流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為水。流動(dòng)相比例為:初始,A為10%,B為90%;3 min時(shí),A為60%,B為40%;5.5~7 min時(shí),A為100%,B為0。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 硅膠柱分離虎眼萬年青皂苷

      稱取虎眼萬年青總皂苷5 g,硅膠柱層析方法分離。由圖1可知,分離產(chǎn)物按照極性由小到大順序流出,瓶號(hào)25~28,48~56,72~77,86~89,97~122為單點(diǎn),單獨(dú)收集,分別標(biāo)記為A、B、C、D、E加以區(qū)分。

      圖1 虎眼萬年青總皂苷硅膠柱分離成分TLC檢測(cè)結(jié)果Fig.1 TLC for Ornithogalum caudaside sample separated by silica gel column chromatograph

      將所得各單體皂苷組分單獨(dú)收集,濃縮后稱重,并計(jì)算得率,對(duì)比如表1。

      表1 各組分洗脫分離收集表Tab.1 Yield of product

      2.2 虎眼萬年青皂苷單體的檢測(cè)

      UPLC檢測(cè)虎眼萬年青總皂苷及分離所得單體。精密稱取各樣品1 mg,分別溶于1 mL乙腈,完全溶解過0.45 μm微孔濾膜,取濾液。其UPLC檢測(cè)圖譜如圖2~7所示。

      由虎眼萬年青總皂苷的色譜圖可以看出,虎眼萬年青總皂苷中含有很多組分,共有12個(gè)峰,其中D、E組分的峰值較高,峰面積也相對(duì)較大,含量相對(duì)較高,比較各色譜圖,可以看出,本次硅膠柱層析對(duì)D、E組分的純化效果較好。各樣品保留時(shí)間及峰面積所占比例情況見表2。

      圖2 虎眼萬年青總皂苷色圖譜Fig.2 Chromatogram of caudaside

      圖3 A組分色譜圖Fig.3 Chromatogram of A sample

      圖4 B組分色譜圖Fig.4 Chromatogram of B sample

      圖5 C組分色譜圖Fig.5 Chromatogram of C sample

      圖6 D組分色譜圖Fig.6 Chromatogram of D sample

      圖7 E組分色譜圖Fig.7 Chromatogram of E sample

      表2 各組分色譜分析對(duì)比Tab.2 Analysis for chromatogram of product

      3 結(jié) 論

      硅膠柱分離虎眼萬年青皂苷樣品5 g,TLC跟蹤檢測(cè),按照極性由小到大依次得到5種虎眼萬年青皂苷單體。得率分別為2.6%、2.6%、3.6%、5.4%、12.6%。超高壓液相色譜檢測(cè)各樣品,虎眼萬年青總皂苷中D、E組分的含量相對(duì)較高,本次硅膠柱層析對(duì)D、E組分的分離效果相對(duì)較好。采用硅膠柱層析的方法可以初步達(dá)到分離純化虎眼萬年青總皂苷的目的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)今后研究虎眼萬年青單體皂苷的分子結(jié)構(gòu)及其藥理活性打下一定的基礎(chǔ)。

      [1] MIMAKI Y, KURODA M, KAMEYAMA A, et al. Cholestane glycosides from Ornithogalum saundersiae and their potent cytotoxic activity on various malignant tumor cells[J]. Tennen Yuki Kagohutsu Toronkai Koen Yoshishu, 1996, 38:313-318.

      [2] 石磊,李娟,劉志強(qiáng),等. 虎眼萬年青多糖增強(qiáng)非特異性免疫和體液免疫的作用[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2002, 28(3):232-234.

      [3] 石磊,段秀梅,胡夢(mèng)林,等. 虎眼萬年青多糖對(duì)小鼠T細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-2mRNA表達(dá)的影響[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2004, 30(5):678-680.

      [4] 石磊,譚巖. 虎眼萬年青多糖對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國免疫學(xué)雜志, 2002, 18(11):799-803.

      [5] TANG Yuping, YU Biao. The chemical constituents from bulbs of Ornithogalum caudatum[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2001, 10(4): 26-28.

      [6] 肖沖,魚紅閃. 虎眼萬年青皂苷的分離提取[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 25(2):93-95.

      (XIAO Chong, YU Hong-shan. Separation and extraction of caudaside[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2006, 25(2): 93-95.)

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