范艷燕

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院東院／南京市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科 210003）

宮頸癌是女性生殖道惡性腫瘤發(fā)病率最高的腫瘤，在所有女性癌瘤中也僅居乳腺癌之后，嚴(yán)重危害婦女健康。據(jù)2000年世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)，每年全世界約有50萬(wàn)新發(fā)病例；而中國(guó)每年的新發(fā)病例為13萬(wàn)以上，每年有2～3萬(wàn)婦女死于宮頸癌?？梢?jiàn)臨床上迫切需要更新、更可靠的宮頸癌腫瘤標(biāo)記物作為評(píng)價(jià)預(yù)后及指導(dǎo)治療的指標(biāo)。本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌患者腫瘤細(xì)胞胞核中核因子－κB（NF－κB）p65的表達(dá)來(lái)探討其臨床意義。

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象 選擇1998年1月1日至2008年8月31日在南京市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科住院行手術(shù)治療的宮頸癌患者43例，術(shù)前均無(wú)化、放療及其他治療史，所有患者不合并其他炎癥疾病。年齡35～67歲，中位48歲。臨床分期按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2000年標(biāo)準(zhǔn)［1］：Ⅰa期9例，Ⅰb期20例，Ⅱa期14例；病理分級(jí)：高分化（G1）14例，中分化（G2）18例，低分化（G3）11例；病理類(lèi)型：鱗癌38例，腺癌5例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。選擇同期在此因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）行宮頸錐切術(shù)的病例32例（CINⅠ15例，CINⅡ8例，CINⅢ9例）和在門(mén)診行宮頸活檢術(shù)為正常宮頸者43例作為對(duì)照。所有病例標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。標(biāo)本經(jīng)甲醛固定常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片。

1.2 試劑 NF－κBp65兔抗人單克隆抗體購(gòu)自福建邁新公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Envision試劑盒購(gòu)自美國(guó)DAKO公司。

1.3 檢測(cè)方法 免疫組化染色采用Envision二步法［2］。常規(guī)脫蠟，放入枸櫞酸鈉緩沖溶液（10mmol／L，pH6.0）中，微波爐170W加熱16min抗原修復(fù)。滴加NF－κBp65抗體4℃過(guò)夜。用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）漂洗10min，山羊抗兔Envision二抗（1∶100）37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知骨髓瘤組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿或胞核著色呈黃色［3］。NF－κBp65亞單位在腫瘤細(xì)胞漿、細(xì)胞核均有表達(dá)，因?yàn)榛罨膒65蛋白只有進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，故陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)以核染色為準(zhǔn)［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 NF－κBp65的表達(dá)量采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 NF－κBp65的表達(dá) NF－κBp65在宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ和正常宮頸組織的表達(dá)陽(yáng)性率分別為67.4%（29／43）、66.7%（6／9）、25.0%（2／8）、6.7%（1／15）、0%（0／43）。正常宮頸組與CINⅠ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.31，P＞0.05）；CINⅠ組與 CINⅡ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.27，P＞0.05）；CINⅡ組與CINⅢ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1.49，P＞0.05）；CINⅢ組與宮頸癌組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.39，P＞0.05），宮頸癌組與正常宮頸組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝54.52，P＜0.001），宮頸癌組與正常宮頸組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝54.52，P＜0.001），見(jiàn)表1。

2.2 NF－κBp65表達(dá)與臨床病理關(guān)系 NF－κBp65在Ⅰa期的表達(dá)陽(yáng)性率為33.3%，Ⅰb期為65.0%，Ⅱa期為92.9%，三者兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在G1～2的表達(dá)陽(yáng)性率為57.1%，G3為72.4%，二者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.472，P＞0.05）；在鱗癌中的表達(dá)陽(yáng)性率為68.4%，腺癌為60.0%，二者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.017，P＞0.05）；在無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)陽(yáng)性率為43.8%，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為81.5%，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.511，P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 NF－κBp65在宮頸癌、CIN和正常宮頸組織的表達(dá)

表2 NF－κBp65表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

3 討 論

腫瘤發(fā)病機(jī)制在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究證明許多基因及細(xì)胞因子在宮頸癌的演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)對(duì)NF－κB進(jìn)行的大量研究發(fā)現(xiàn)，其是具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的序列特異性DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞因子的產(chǎn)生［5］。

NF－κB是1986年Sen和Baltimore首先從B淋巴細(xì)胞核抽提物中檢驗(yàn)出的［6］，是由兩個(gè)亞單位構(gòu)成的二聚體復(fù)合物。其中由p65和p50或p52亞單位構(gòu)成的異二聚體幾乎存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞未受到刺激時(shí)，NF－κB二聚體與其抑制物結(jié)合，不具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力［7］。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)毒素、過(guò)氧化物、細(xì)胞毒素、紫外線、離子射線等細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，NF－κB被“釋放”，迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，參與細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、急性期蛋白、免疫受體、轉(zhuǎn)錄因子等基因的轉(zhuǎn)錄［8］，影響細(xì)胞增殖、凋亡，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)影響抗腫瘤細(xì)胞毒性藥物及離子輻射的敏感性。

本研究結(jié)果顯示，NF－κBp65在宮頸癌、CIN和正常宮頸組織表達(dá)陽(yáng)性率有明顯差異；在宮頸癌中，Ⅰa期、Ⅰb期和Ⅱa期三者比較，表達(dá)陽(yáng)性率有明顯差異，盆腔有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)陽(yáng)性率有明顯差異，說(shuō)明NF－κB與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并在其中起重要的調(diào)節(jié)作用。提示利用測(cè)定NF－κBp65含量，可以預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，正常宮頸組與CINⅠ組、CINⅠ組與CINⅡ組、CINⅡ組與CINⅢ組、CINⅢ組與宮頸癌組兩兩比較，NF－κBp65表達(dá)均無(wú)明顯差別，可能尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，但也從另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療、積極治療癌前病變可以阻斷宮頸癌的發(fā)生。

目前關(guān)于NF－κB在宮頸癌各個(gè)病理分級(jí)中的表達(dá)是否存在差異的報(bào)道各不相同。本研究結(jié)果顯示，NF－κBp65在宮頸癌中的表達(dá)與病理分級(jí)無(wú)關(guān)，要明確NF－κBp65表達(dá)與宮頸癌病理分級(jí)的關(guān)系可能尚需要更大的樣本量來(lái)解決。宮頸鱗癌和腺癌之間的表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，這一方面可能因?yàn)槿祟?lèi)乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌（無(wú)論鱗癌還是腺癌）發(fā)生的關(guān)鍵因素，所以?xún)烧叨贾饕鞘蹾PV刺激，使受抑制的NF－κB活化，參與腫瘤的發(fā)生；另一方面可能是因?yàn)镹F－κB幾乎存在于所有真核細(xì)胞里，參與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，所以無(wú)論是在鱗癌細(xì)胞里還是在腺癌細(xì)胞里也都廣泛存在，導(dǎo)致NF－κB在鱗癌和腺癌之間的表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)差別。

總之，有可能通過(guò)免疫組化檢測(cè)方法篩選宮頸癌陽(yáng)性患者，指導(dǎo)臨床宮頸癌患者個(gè)體化治療方案的選擇，進(jìn)一步將導(dǎo)向化療及靶向治療的觀念引入宮頸癌新輔助化療領(lǐng)域，為抗腫瘤提供一個(gè)新的途徑。

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