馮勁立，汪德龍，張奉學

（廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所，廣東 廣州 510405）

流行性感冒，簡稱流感，是一種由正粘病毒科流感病毒（Influenza vitus，IFV）引起的急性呼吸道傳染病，是人類至今尚不能有效控制的世界性傳染病，好發(fā)于冬春季節(jié)，其輕則局部爆發(fā)，重則引起世界性大流行。流感在中醫(yī)學屬于“四時感冒”、“時行感冒”和“瘟疫”范疇，多為感受外界邪毒、疫氣而發(fā)病，在臨床上多表現(xiàn)為“衛(wèi)氣同病”的癥候。由清代溫病學家吳鞠通所創(chuàng)制的新加香薷飲，其組方精妙，所用藥物種類少且用量輕，但作為濕溫感冒的代表方藥，常被運用到流行性感冒的臨床治療當中，且每獲良效。本實驗利用新加香薷飲及其組方藥物進行體內(nèi)外抗甲1型流感病毒的比較研究，現(xiàn)將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 NIH小鼠220只，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供(粵監(jiān)證字2008A021)，單一性別（均為雄性），體質(zhì)量13～15 g。小鼠飼料由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。 飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為（23±2）℃，相對濕度為（75±10）%。

1.1.2 藥物 新加香薷飲：新加香薷飲《溫病條辨》原方（香薷、厚樸、連翹各 6 g，扁豆花、銀花各 9 g），參考《中醫(yī)方劑大辭典》[1]、《方劑學》[2]中的方法進行制備。根據(jù)《中藥藥理研究方法學》[3]按照體表面積換算。其含生藥量分別為 高 劑 量 0.292 g/mL， 中 劑 量 0.146 g/mL， 低 劑 量0.073 g/mL（以下簡稱復方高、中、低劑量組）。5種單藥用量則按預實驗結果以及參考各生藥最大用量配制 （含生藥 量 為 香 薷 0.188 g/mL， 厚 樸 0.188 g/mL， 扁 豆 花0.188 g/mL，銀花 0.619 g/mL，連翹 0.319 g/mL），以上中藥均購自廣州中醫(yī)藥大學中藥房，制成100%水提液，間歇滅菌后，以蒸餾水配成相應濃度備用。陽性對照藥：病毒唑由肇興星湖醫(yī)藥銷售有限公司提供，批號：051008，配成3.5 mg/mL溶液備用。

1.1.3 病毒 甲型流感病毒FM1鼠肺適應株 （LD50為3.81），由廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所病毒室提供。

1.1.4 儀器 YJ－875醫(yī)用凈化工作臺 （蘇州凈化設備公司）；壓力蒸氣滅菌器（上海南華醫(yī)療器械廠）；超純水器（Millipore）；超低溫冰箱（Sanyo 日本）；萬分之一電子分析天平，F(xiàn)A/JA系列（上海良平儀器儀表有限公司）；乙醚（天津化學試劑有限公司）；0.9%生理鹽水 （開開援生物制藥有限公司）；架盤藥物天平（福州天平儀器廠）；臺式離心機（上海萬達生物工程公司）；解剖剪，眼科鑷，24孔血凝板，1 mL一次性注射器，5 mL EP管等。

1.1.5 雞血球懸液 于公雞翅下肱靜脈采血，離心，用0.9%生理鹽水洗滌，洗滌后的雞紅血球用0.9%生理鹽水配成0.5%的混懸液。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺指數(shù)的觀察 ①稀釋毒種：取甲型流感病毒FM1鼠肺適應株，以無菌生理鹽水稀釋成濃度約為15個LD50的病毒液，冰浴保存；②攻毒：取小鼠110只，隨機分成11組，分別為正常組、模型組、陽性藥物組、復方高、中、低劑量組、香薷組、厚樸組、扁豆花組、銀花組及連翹組。除正常組外，其余各組乙醚麻醉后，以滴鼻法感染,每鼠4滴（左右鼻孔各2滴），約0.05 mL/只?？瞻捉M以等量蒸餾水代替；③給藥：各組均于攻毒前1 d開始以灌胃方式給藥。各藥物組灌胃量為0.2 mL/次，2次/d?？瞻准澳Ｐ徒M則灌以等量蒸餾水代替，共5 d；④測量肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率：各組于攻毒4 d后處死，稱體質(zhì)量及肺質(zhì)量，計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。

1.2.2 流感小鼠死亡保護的測定 ①稀釋毒種：病毒同上，以無菌生理鹽水稀釋成濃度約為5個LD50病毒液，置冰水中保存。②攻毒：方法與病毒用量同上；③給藥：各組均于病毒攻擊后2 h開始給藥，給藥劑量與肺指數(shù)實驗相同，0.2 mL/次，2 次/d，共 12 d，空白組與模型組均用等量蒸餾。④觀察：逐日觀察動物發(fā)病及死亡數(shù)，共觀察15 d。死亡小鼠解剖觀察鼠肺，以有++到++++的病變作為流感病毒感染的判斷標準。并根據(jù)觀察結果計算死亡保護率與延長生命率。

1.2.3 血凝滴度測定 ①毒種準備、感染小鼠及給藥：均按照肺指數(shù)實驗方法進行；②病毒液的制備：各組小鼠于攻毒后72 h后處死，取鼠肺，加入生理鹽水，按肺重（g）/生理鹽水（mL）=1/9比例配備成鼠肺懸液，經(jīng)3 000 r/min離心沉淀20 min后，提取上清液備用；③血凝滴度檢測：實驗步驟及評測指標均按 《流行性感冒病毒及其實驗技術》[4]介紹方法評測標準進行，并以形成“++”凝集的病毒液最高稀釋度的倒數(shù)為其血凝效價。

1.3 統(tǒng)計學分析

肺指數(shù)及死亡保護實驗結果，均采用軟件包SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理，存活時間用秩和檢驗，存活率用χ2檢驗。

2 結果

2.1 新加香薷飲對流感病毒所致小鼠病毒性肺炎的影響

小鼠肺指數(shù)實驗結果表明，復方高、中、低劑量對小鼠流感病毒性肺炎均有明顯的抑制作用，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中，復方高劑量組對小鼠流感病毒性肺炎有明顯的抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與組方藥物組比較，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果見表1。小鼠死亡保護實驗結果顯示，復方高、中、低劑量均能延長病鼠生存時間并降低病鼠死亡率，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中復方高劑量的效果尤為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并高于各組方藥物，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果見表 2。

表1 新加香薷飲及其組方藥物對受感染小鼠體內(nèi)流感病毒的抑制作用 （n=10，±s）

表1 新加香薷飲及其組方藥物對受感染小鼠體內(nèi)流感病毒的抑制作用 （n=10，±s）

注：若2 d之內(nèi)死亡者不計。與正常組比較☆☆P＜0.01；與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與銀花組比較 #P＜0.05。

組 別正常組模型組病毒唑組復方高劑量組復方中劑量組復方低劑量組香薷組厚樸組扁豆花組銀花組連翹組藥物劑量（g/kg）抑制率（%）— —— —3.529 0.292 0.146 0.073 0.188 0.188 0.188 0.619 0.319肺指數(shù)值1.05±0.08 1.75±0.23☆☆1.09±0.19**1.11±0.14**#1.26±0.06**1.31±0.38*1.78±0.02 1.66±0.16 1.70±0.35 1.27±0.52**1.32±0.18*94.29 91.43 75.71 62.86—12.86 7.14 72.86 61.43

表2 新加香薷飲及其組方藥物對感染流感病毒小鼠的死亡保護和延長病鼠生命的作用 （n=10，±s）

表2 新加香薷飲及其組方藥物對感染流感病毒小鼠的死亡保護和延長病鼠生命的作用 （n=10，±s）

注： 與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與銀花組比較 #P＜0.05。

）扁豆花組銀花組連翹組1 045 100 40 50 0 60*50*0 13.1*12.1*#0 74.67*61.33*

2.2 新加香薷飲對雞紅血球血凝滴度的影響

血凝試驗結果顯示，高、中、低劑量的新加香薷飲對紅血球凝集起到抑制作用，其中高劑量組和中劑量組新加香薷飲血凝滴度抑制率更達到100%，結果見表3。

表3 新加香薷飲及其組方藥物對甲1型流感病毒血凝滴度的抑制作用

3 討論

流行性感冒，簡稱流感，是一種由正粘病毒科流感病毒（Influenza vitus，IFV）引起的急性呼吸道傳染病，是人類至今尚不能有效控制的世界性傳染病。該病常呈自限性，具有潛伏期短、傳染性強、傳播速度快等特點，發(fā)病率在傳染病中高居首位。由于人群對變異的流感病毒普遍缺乏持久免疫力，所以很容易引起爆發(fā)流行。流感每年的發(fā)病率大約在5%～15%之間，在人群相對稠密的場所，發(fā)病率更可以達到20%～30%。作為流感高發(fā)區(qū)的我國，每年就有近1.3億人感染流感。中醫(yī)治療外感的三大經(jīng)典方藥之一的新加香薷飲，經(jīng)大量臨床驗證顯示出，其具有良好的抗流感作用，而且方中的組成藥物香薷、厚樸、金銀花及連翹，均已通過實驗證明具有良好的抗病毒作用[5－8]，但是關于新加香薷飲抗病毒的作用及機制研究則少見具體的研究報道。因此本實驗旨在通過測量小鼠肺指數(shù)、肺指數(shù)抑制率、死亡保護實驗及凝血試驗測定新加香薷飲及其組方藥物抗流感病毒的效果，并進行比較研究。

通過小鼠肺指數(shù)及死亡保護實驗研究結果所得，高劑量組的新加香薷飲復方在肺指數(shù)、死亡保護率和平均存活時間方面均優(yōu)于各單味藥組（P＜0.05），其藥效與劑量更存在正相關關系，從而提示新加香薷飲復方對流感病毒甲1型感染小鼠具有一定的抑制作用。此外，新加香薷飲對雞紅血球凝集作用的實驗結果顯示高、中、低劑量的新加香薷飲復方均能減低流感病毒血凝滴度,即減少了流感病毒感染的病毒量，抑制病毒增殖，從而顯示了良好的抗病毒作用。其中以高劑量組的新加香薷飲復方的效果最為顯著，并呈量效相關關系。

綜上所述，新加香薷飲復方體內(nèi)外實驗中的抗流感病毒效果均優(yōu)于方中的單味藥物。由于其由多種中藥組成，方中起效因素涉及多種中藥活性成分，但活性成分間的作用機制復雜，因此新加香薷飲復方的抗流感機制仍不明朗，還有待進一步研究。

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