VB1對(duì)平菇天達(dá)300液體菌種菌絲體和胞外多糖含量的影響

王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

VB1對(duì)平菇天達(dá)300液體菌種菌絲體和胞外多糖含量的影響

王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

在平菇天達(dá)300液體培養(yǎng)基中加入VB1作為刺激因子,測(cè)量其對(duì)平菇天達(dá)300菌絲體干重和胞外多糖含量的影響.實(shí)驗(yàn)表明,在培養(yǎng)基中加入不同濃度的VB1對(duì)平菇天達(dá)300菌絲體含量無明顯影響；而加入不同濃度的VB1對(duì)胞外多糖含量的影響明顯，當(dāng)濃度為0.75mg/L時(shí)，胞外多糖的含量達(dá)到最大值.

平菇天達(dá)300；VB1；胞外多糖；菌絲體干重

平菇隸屬于真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，無隔擔(dān)子菌亞綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬（Pleurotus）亦稱平菇屬.

平菇是一種木腐真菌，自然情況下生長(zhǎng)在楊、榆、柳、槐等多種死亡的闊葉樹干上.平菇適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，凡含有木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的原料均可培養(yǎng)平菇，而且生產(chǎn)周期短，生物效率高，因此它是具有投資少、成本低、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)的一種栽培菌.

平菇的營(yíng)養(yǎng)十分豐富，它的蛋白質(zhì)含量高，占干重的30%~40%，并含有多種氨基酸，纖維素和礦物質(zhì)，是人體所需要的維生素（硫胺素、核黃素、煙酸）和礦物質(zhì)（磷、鐵、鉀、鈣）等的良好營(yíng)養(yǎng)源.

平菇的代謝產(chǎn)物很豐富，有抗腫瘤的多糖蛋白，有抗菌作用的抗生素，有降低血壓、防治腦血管障礙的微量牛黃酸、有利于胃腸功能的菌多糖、甘露糖、維生素和幫助消化的各種酶，還有抗衰老、增強(qiáng)免疫功能的硒元素，因此多食平菇既可增加營(yíng)養(yǎng)又可防治高血壓、心血管病、糖尿病、癌癥、中年肥胖癥等疾病.

VB1是多數(shù)真菌生長(zhǎng)發(fā)育的必需因子，本文研究了不同濃度VB1對(duì)平菇天達(dá)300液體菌種菌絲體生長(zhǎng)和胞外多糖含量的影響.

實(shí)驗(yàn)流程：PDA培養(yǎng)基的制備—→母種的擴(kuò)繁—→液體培養(yǎng)基的制備—→液體菌種接種—→搖床培養(yǎng)—→胞外多糖及菌絲體干重的測(cè)定.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種：平菇天達(dá)300（由江蘇省江都市天達(dá)食用菌研究所提供）.

1.1.2 儀器：滅菌鍋、烘干箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái) 、水浴鍋、搖床、723分光光度計(jì).

1.2 實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置

實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置

1.3 方法

1.3.1 母種培養(yǎng)基的制備、滅菌及檢測(cè)

母種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g，瓊脂20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml

清洗1000ml燒杯2個(gè)、玻璃棒1根、試管20個(gè)、棉塞20個(gè).選擇質(zhì)量較好的馬鈴薯（無病、未出芽、不干縮）洗凈去皮，挖去芽眼，切成薄片稱取200克，加水1000ml.煮沸10~15分鐘，至酥而不爛的程度，用4~6層紗布過濾一次，取其濾液，加入瓊脂20克，用小火加熱至瓊脂全部溶解，如果濾液不足1000ml需加水補(bǔ)足，煮沸后加入葡萄糖20克，攪拌溶解，調(diào)解pH值（pH=6）將調(diào)好PH值的培養(yǎng)基趁熱及時(shí)分裝18mm×180mm或20mm×200mm的試管中.一般裝入量為試管總長(zhǎng)度的1/4.分裝時(shí)，應(yīng)盡量注意勿使培養(yǎng)基黏附在試管口壁上，如有黏附則用干紗布擦去，分裝的試管塞上棉塞，棉塞的作用是保證通氣性，防止雜菌污染.所以棉塞必須大小適當(dāng)，松緊合適.棉塞在試管內(nèi)外的比例為2：1.

塞好棉塞的試管每10支捆成一捆，上面用一層牛皮紙或二層報(bào)紙包扎好，以免滅菌時(shí)水蒸氣浸濕棉塞.然后豎直放入高壓鍋內(nèi)滅菌30分鐘,滅菌壓力1.47×105Pa,溫度為121℃.

滅菌后，待滅菌鍋內(nèi)的溫度降到60℃ 時(shí)取出試管制成斜面，斜面的長(zhǎng)度以占試管的總長(zhǎng)度的3/4為宜.

凝固后的斜面培養(yǎng)基，在使用前應(yīng)進(jìn)行無菌檢測(cè)，即從制備的斜面培養(yǎng)基中隨機(jī)抽取3~5支，置于30℃±1℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，如培養(yǎng)基表面光滑，無雜菌出現(xiàn)方可使用.

1.3.2 母種擴(kuò)繁及培養(yǎng)

將所用器具：接種鏟、斜面試管、酒精燈,75%酒精棉球放入超凈工作臺(tái)進(jìn)行紫外燈滅菌30分鐘.

將菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管用大拇指和其他四指握在左手中，斜面向上，并使它們位于水平位置，也可將試管放在左手，用手掌托住試管.

先將棉塞用右手?jǐn)Q轉(zhuǎn)松動(dòng)，以利于接種時(shí)拔出，右手拿接種鏟（在火焰上燒紅滅菌，在接種時(shí)可能進(jìn)入試管的長(zhǎng)柄部分也應(yīng)灼燒滅菌）.

左手拿的試管要靠近火焰旁，用右手小指、無名指和手掌拔掉棉塞；用火焰灼燒管口（靠手腕動(dòng)作）以殺死上面沾染的雜菌.

在火焰旁，將燒過的接種鏟水平伸入菌種管內(nèi)，先接觸沒有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌種.然后切取蠶豆大的一小塊菌塊，慢慢將菌種鏟抽出，注意不要使菌種碰到試管內(nèi)壁，取出后不可使菌塊通過火焰，迅速將接種鏟在火焰旁伸進(jìn)另一試管，將菌塊放在培養(yǎng)基中部，慢慢抽出接種鏟后，勿碰試管內(nèi)壁，然后塞好棉塞，灼燒試管口和棉塞，重復(fù)上述操作.將接好的試管放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)7天左右，待菌絲長(zhǎng)滿斜面，選取菌絲生長(zhǎng)健壯、潔白、濃密、均勻的優(yōu)質(zhì)菌種進(jìn)行使用或保藏，.在此期間應(yīng)每天觀察一次，觀察是否有雜菌感染，如果有及時(shí)將試管取出，以免污染其它菌種.

1.3.3 液體培養(yǎng)基的制備

1.3.3.1 液體培養(yǎng)基配方

玉米粉 5%，MgSO40.15g，KH2PO40.15g，100ml蒸餾水

清洗錐形瓶12個(gè)、玻璃棒5根、1000毫升燒杯7個(gè)，烘干待用.制作12個(gè)棉塞要求兩層紗布中間加一層厚約0.5cm的棉花（要保證通氣性，防止雜菌侵染）.準(zhǔn)確稱量玉米粉 5g,MgSO40.15g，KH2PO40.15g，蒸餾水 100ml.用電子秤精確量取VB10.05mg，定容至200ml，即所配制VB1母液濃度為0.25mg/L.

1.3.3.2 液體培養(yǎng)基的制備過程

取5個(gè)1000ml大燒杯，各放入玉米粉4份，每份5g然后各加蒸餾水500ml（含蒸發(fā)量），用玻璃棒攪拌，放在70℃恒溫水浴鍋內(nèi)保溫1小時(shí)，并用玻璃棒不斷攪拌，1小時(shí)后取出燒杯靜置10分鐘，用8層紗布過濾，提取上清液.用100ml量筒量取上清液100ml放入事先準(zhǔn)備好的、分別裝有MgSO40.15g，K.H2PO40.15g的錐形瓶?jī)?nèi).然后向每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)加入玻璃珠15顆.

把12個(gè)錐形瓶分成2組，編號(hào)，分別標(biāo)記VB1的濃度為：1號(hào)0mg/L,2號(hào)0.25mg/L,3號(hào)0.5mg/L,4號(hào)0.75mg/L,5號(hào)1.0mg/L,6號(hào)1.25mg/L.每個(gè)濃度各3瓶.用移液槍吸取0.25mg/l,0.5mg/l,0.75mg/l,1.0mg/l,1.25mg/l的 VB1放入對(duì)應(yīng)的錐形瓶?jī)?nèi).0mg/l的3瓶作為對(duì)照組.搖勻，用棉塞加二層報(bào)紙包裹用橡皮筋扎住，放在滅菌鍋內(nèi)滅菌35分鐘（滅菌過程同上）.

1.3.4 液體菌種接種、搖床培養(yǎng)及斜面培養(yǎng)基的保藏

首先將接種工具及菌種置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外線滅菌30分鐘.操作時(shí)首先點(diǎn)燃酒精燈，用酒精棉球擦拭雙手、所用器具和斜面菌種.把錐形瓶上的棉塞松動(dòng).拔掉試管棉塞，保持管口水平，灼燒試管口，同時(shí)灼燒接種鏟，兩者在酒精燈兩側(cè)的同一條水平線上，邊灼燒邊伸入試管內(nèi)，離菌絲1cm處，將二者同時(shí)離開火焰，待接種鏟冷卻后，鏟出面積為1.5cm2的菌塊（盡量保持所有菌塊大小一致），用右手掀去錐形瓶棉塞將菌塊無菌接入液體培養(yǎng)基內(nèi)，保持菌絲朝上，扎上棉塞，連續(xù)接種（注意斜面菌種所帶的培養(yǎng)基越薄越好）.取出錐形瓶，放入25±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置24小時(shí)，記錄時(shí)間.

次日同一時(shí)間將液體菌種放入25±1℃，180r/min搖床上振蕩培養(yǎng)7天,在這期間要每天觀察1—2次,首先看是否有雜菌感染,其次是注意保持通風(fēng)保證菌絲體有氧呼吸,最后觀察菌絲球的生長(zhǎng)狀況,菌絲球分布均勻,菌液澄清，有菇香味為生長(zhǎng)成熟.

將剩余斜面菌種放在4℃冰箱中保存.保存方法如下：把聚乙烯塑料薄膜剪成長(zhǎng)20cm、寬4cm的條帶大火灼燒試管口及棉塞，用塑料長(zhǎng)條包裹試管口和棉塞，最后用火焰燒塑料趁熱使其黏合在一起，放入4℃冰箱中保存待用.

1.3.5 菌絲體干重的測(cè)定

搖床培養(yǎng)7天左右菌絲球生長(zhǎng)成熟，將其放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外燈滅菌30分鐘,用6層紗布（有標(biāo)號(hào)且事先稱好重量）過濾，將濾過的菌絲球連同紗布放入與紗布標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿中，在烘干箱內(nèi)60℃烘干稱恒重.

1.3.6 胞外多糖的測(cè)定

1.3.6.1 胞外多糖的測(cè)定原理

采用苯酚—硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)液.

苯酚—硫酸試劑可以與游離的寡糖或多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應(yīng)，己糖在490nm有最大吸收值，吸收值與糖濃度呈線性關(guān)系.

1.3.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取分析純葡萄糖0.1g，用去離子水定容到100ml的容量瓶中，其葡萄糖濃度為1mg/ml.準(zhǔn)確稱取苯酚9g，加54ml去離子水，得濃度為15%的苯酚溶液.取9支試管，1支為空白對(duì)照管，另外選取8個(gè)濃度的葡萄糖溶液來做平行實(shí)驗(yàn)，分別加入 1mg/ml葡萄糖溶液 0ul，160ul，180ul，200ul，220ul，240ul，260ul，280ul，300ul， 再 分 別 加 蒸 餾 水2.0ml，1.84ml，1.82ml，1.80ml，1.78ml，1.76ml，1.74ml，1.72ml，1.70ml，每管中再加入15%的苯酚1ml，振蕩，搖勻，再加入5ml濃硫酸，迅速振蕩搖勻.（具體的藥品添加量見表2）.置25oC水浴鍋中保溫20min，取出，于490nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度（見表3為所測(cè)結(jié)果）.以葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，以光密度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）.

表2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所加藥品列表

表3 490nm處測(cè)定不同葡萄糖濃度吸光值結(jié)果

1.3.6.3 樣品多糖含量的測(cè)定

吸取樣品液0.05ml，按上述步驟操作，繪制曲線，以曲線計(jì)算其多糖含量（表4為樣品光吸收值的測(cè)定結(jié)果）.

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪圖得出所得曲線的方程表達(dá)式y(tǒng)=0.007x－0.241，r=0.969,x為葡萄糖濃度,y為光吸收值根據(jù)表4所得出的樣品光吸收值可以求出樣品中葡萄糖得率，如表5所示.

表4 樣品光吸收值的測(cè)定結(jié)果

表5 由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得樣品中（0.05ml）葡萄糖得率

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度VB1對(duì)平菇天達(dá)300菌絲體得率的影響根據(jù)表6繪制曲線（圖2）.

由圖2得出VB1對(duì)平菇天達(dá)300菌絲體得率的影響并不是太明顯，隨濃度的變化菌絲體得率無明顯的變化.

表6 平菇天達(dá)300菌絲體得率

2.2 不同濃度VB1對(duì)平菇天達(dá)300菌絲體胞外多糖濃度的影響

根據(jù)表5繪制圖3,由圖3可以看出VB1對(duì)胞外多糖的影響較大，曲線在VB1的濃度為0～0.75mg/L時(shí)曲線呈現(xiàn)上升趨勢(shì),到0.75mg/L時(shí)胞外多糖含量達(dá)到最高，爾后隨VB1濃度的升高多糖含量不再上升，甚至有所下降.因此刺激平菇天達(dá)300胞外多糖得率最適的VB1濃度為0.75mg/L.

3 結(jié)論

3.1 在深層發(fā)酵中，平菇天達(dá)300在不添加任何生長(zhǎng)因子時(shí)，菌絲體得率和胞外多糖的含量都比較低.

3.2 在培養(yǎng)基中加入不同濃度的VB1對(duì)平菇天達(dá)300菌絲體生長(zhǎng)均有不同程度的影響.

3.3 當(dāng)?shù)腣B1添加量為0.75mg/L時(shí)胞外多糖含量達(dá)到最大值，而對(duì)菌絲體得率無明顯影響.

3.4 刺激因子在VB10～0.75mg/L范圍內(nèi)與平菇天達(dá)300胞外多糖含量呈正相關(guān)，即隨濃VB1度升高胞外多糖的含量增加.

3.5 刺激因子濃度高于VB10.75mg/L后與平菇天達(dá)300胞外多糖含量呈負(fù)相關(guān)，即隨VB1濃度升高胞外多糖含量降低.

由上述分析可知:在平菇天達(dá)300液體培養(yǎng)基中加入濃度為0.75mg/L的時(shí)對(duì)VB1菌絲體胞外多糖含量影響最明顯,此時(shí)胞外多糖含量達(dá)最大值,但對(duì)菌絲體干重得率影響并不是太明顯,曲線比較平緩.這些應(yīng)用到具體的生產(chǎn)實(shí)踐中可以提高平菇天達(dá)300的質(zhì)量,對(duì)天達(dá)300液體產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義.

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1673-260X（2010）02-0015-04