凝膠柱層析—考馬斯亮藍染色法測定牛奶中的真蛋白質(zhì)

張弘，李博斌，曾金紅，方魏，鄭云峰，孟燕青，夏煒芳

（1．紹興市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江紹興312071；2．杭州天辰儀器儀器設(shè)備有限公司，杭州310013）

凝膠柱層析—考馬斯亮藍染色法測定牛奶中的真蛋白質(zhì)

張弘1，李博斌1，曾金紅1，方魏2，鄭云峰1，孟燕青1，夏煒芳1

（1．紹興市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江紹興312071；2．杭州天辰儀器儀器設(shè)備有限公司，杭州310013）

采用凝膠柱層析和考馬斯亮藍染色相結(jié)合的方法，對多個品種的牛奶進行檢測，詳細(xì)考察牛奶中蛋白質(zhì)的分子量分布特征，對牛奶不經(jīng)過預(yù)處理而直接進行檢測。結(jié)果表明，牛奶中蛋白質(zhì)分子量絕大部分集中分布在1×104～7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白質(zhì)所占的比列很小。綜合應(yīng)用牛奶中蛋白質(zhì)的分子量分布特征和考馬斯亮藍染色法的特性研發(fā)出牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀，該儀器體積小、操作簡便、檢測速度快、靈敏度高，且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸銨等無機氮，及水解植物和動物蛋白等小分子多肽氮對牛奶中蛋白質(zhì)檢測的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白檢測問題，可用于現(xiàn)場牛奶真蛋白質(zhì)快速檢測。

牛奶；蛋白質(zhì)；凝膠柱層析；考馬斯亮藍染色；快速檢測儀

0 引言

牛奶及乳制品中含有豐富的蛋白質(zhì)，但在牛奶收購、生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，質(zhì)量摻假事件時有發(fā)生，尤以“劣質(zhì)假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件為甚。目前檢測蛋白質(zhì)的國家標(biāo)準(zhǔn)方法是凱氏定氮法，其結(jié)果只是氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而不是真正意義上的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這種缺陷造成某些不法分子對牛奶進行摻假，添加硫酸銨、三聚氰胺、水解植物或動物蛋白等含氮物質(zhì)。要杜絕這類問題，必須建立真蛋白質(zhì)的檢測方法。含氮物質(zhì)的檢測方法目前有：凱氏定氮法、紅外光譜法和電泳法等[1-10]。本文采用凝膠柱層析-考馬斯亮藍染色法對牛奶中蛋白質(zhì)的分子量分布特征進行考察，并結(jié)合考馬斯亮藍染色法的特性研發(fā)出牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀，解決牛奶中摻假蛋白的檢測問題。

1 實驗

1.1 材料

取2只有準(zhǔn)確來源、不含有其他氮源的純牛奶和脫脂奶(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%,全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.47%)標(biāo)樣，同時分別向上述空白純牛奶和脫脂奶中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%和0.10%的外源無機氮物質(zhì)三聚氰胺、硫酸銨和尿素，及小分子多肽氮物質(zhì)水解植物和動物蛋白，采用蛋白質(zhì)分離檢測儀測定其蛋白質(zhì)分子量分布圖形和牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀進行直接測定讀數(shù)?？捡R斯亮藍G-250染料作為蛋白質(zhì)染色劑。

1.2 儀器

蛋白質(zhì)分離檢測儀和牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀(TCDB-3型)。蛋白質(zhì)分離檢測儀是基于凝膠柱層析—考馬斯亮藍染色法的原理設(shè)計制造的。其儀器原理、結(jié)構(gòu)及軟件系統(tǒng)與醬油蛋白質(zhì)檢測儀(B型)相同[11]。

1.3 方法

本儀器采用標(biāo)準(zhǔn)樣品定標(biāo)的方法，經(jīng)儀器的自動計算處理后，將溶液中的吸光度轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從顯示屏上直接讀數(shù)。

圖1為基于考馬斯亮藍染色法的牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀器結(jié)構(gòu)。圖1中，由電源發(fā)出的復(fù)合光，經(jīng)單色器（濾光鏡）得到需要的595 nm單色光，經(jīng)透鏡聚焦后到達比色池，再到接收器（光電池）。光電池將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)前置放大器放大，信號轉(zhuǎn)入A/D轉(zhuǎn)換器，A/D轉(zhuǎn)換器將模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號后送往單片機進行數(shù)據(jù)處理。操作者將有關(guān)信息通過鍵盤告訴單片機，單片機將處理結(jié)果通過顯示屏告訴操作者。

圖1 考馬斯亮藍染色法的牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀器結(jié)構(gòu)

顯色劑的改良：考馬斯亮藍染色測定蛋白質(zhì)是一種經(jīng)典的方法，但按傳統(tǒng)方法配成的顯色劑卻存在著溶解不完全、比色池上極易沉積等問題，實際操作時對測定的準(zhǔn)確性干擾較大。為此本研究對考馬斯亮藍顯色劑中進行了改良，加入了大分子的醇類和酚類物質(zhì)，新研制的顯色劑溶液溶解度好，比色池上沉積很少，且穩(wěn)定，存放一年不影響測定。

2 結(jié)果及分析

2.1 牛奶中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其分布譜圖

本研究選取了市場上比較常見的純牛奶和脫脂奶作為試驗對象，探討牛奶中的蛋白質(zhì)分子量范圍及分布特征。純牛奶和脫脂奶標(biāo)樣及添加外源含氮物質(zhì)后的檢測結(jié)果如圖2-圖9所示（純牛奶中添加硫酸銨、水解動物蛋白的圖譜分別與圖4、圖5相似，省略；脫脂奶中添加硫酸銨、水解動物蛋白的圖譜分別與圖8、圖9相似，省略）。

由圖2-圖9可以看出，純牛奶圖譜上有一個飽滿銳尖峰和一峰形不很明顯的拐角小峰，而脫脂奶圖譜上有2個明顯峰形；純牛奶與脫脂奶膠體乳液中的蛋白質(zhì)分子量絕大部分集中分布在1×104u,而7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白質(zhì)所占的比列很小，即這兩種牛奶中蛋白質(zhì)分子量總體分布范圍基本一致；但由于脫脂奶中脂肪被去除，導(dǎo)致脫脂奶中脂肪球形成的乳狀液膠體體系的破壞，對脫脂奶膠體體系中蛋白質(zhì)的聚集產(chǎn)生影響，脫脂后大分子量蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)的比例明顯減少，因而兩峰的峰高(對應(yīng)不同分子量蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與比例)有所變化，第一峰的峰高明顯減少，第二峰的峰高增加。

圖2 純牛奶標(biāo)樣的圖譜

圖3 純牛奶+三聚氰胺的圖譜

圖4 純牛奶+尿素的圖譜

圖5 純牛奶+水解植物蛋白的圖譜

圖7 脫脂奶+三聚氰胺的圖譜

圖8 脫脂奶+尿素的圖譜

圖9 脫脂奶+水解植物蛋白的圖譜

本研究首次對牛奶不經(jīng)過預(yù)處理而直接進行檢測。牛奶的蛋白質(zhì)主要為酪蛋白和乳清蛋白兩大類，其分子量分布常用的檢測方法是：先將牛奶脫脂，然后調(diào)pH值將酪蛋白在等電點時沉淀，洗凈后pH值調(diào)回已溶解狀態(tài)，再用電泳法，薄層層析法、高效液相色譜法等方法檢測。這些方法檢測得到的結(jié)果是，牛奶中的蛋白質(zhì)基本上以單體形式存在，很少量的有二聚體，分子量大致為1×104～7×104u。牛奶不經(jīng)處理直接測分子量分布，除了本研究，尚未有報導(dǎo)。本研究測得的牛奶蛋白質(zhì)分子量在1～1×104u左右，不是意味牛奶蛋白中的分子量有幾萬或約104u，而是牛奶中的部分蛋白質(zhì)以多個單體聚集的狀態(tài)存在，脫脂后這部分聚集狀態(tài)的比例明顯減少。

此外，對比圖2-圖9，純牛奶和脫脂奶中加入外源性三聚氰胺、硫酸銨和尿素等無機氮，及水解植物和動物蛋白等小分子多肽氮物質(zhì)后，所得的與它們的標(biāo)樣圖譜非常相似，出峰時間段及峰高、蛋白質(zhì)分子量總體分布范圍基本一致，表明這些外援氮添加物對它們的圖譜幾乎沒有影響，也就是對考馬斯亮藍測定純牛奶與脫脂奶中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎沒有干擾。

2.2 牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀

牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀的設(shè)計原理是基于牛奶中蛋白質(zhì)的分子量分布特征和考馬斯亮藍染色法的特性。分子量約1 ku以上含氮物中的肽鏈和考馬斯亮藍結(jié)合，在波長595 nm處達到最大吸收值。而通過蛋白質(zhì)分離檢測儀測定的結(jié)果表明：牛奶中的蛋白質(zhì)分子量集中分布在1×104～7×104u，和考馬斯亮藍染色劑的顯色作用非常明顯，因此靈敏度很高。

2.2.1 線性研究

取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的卵清蛋白溶液)，分別取體積為10，15，20，25和30 μL，與質(zhì)量濃度為10 mg/L的20 mL新研制的考馬斯亮藍顯色劑混合，按照儀器使用說明書操作，通過快速檢測儀的顯示值(直接讀數(shù))與標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）的對應(yīng)關(guān)系(原取樣體積)來衡量儀器檢測性能的歸一性(線性)，結(jié)果如圖10所示。

圖10 牛奶蛋白質(zhì)快速儀顯示值與添加量曲線

由圖10可以看出，牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀的響應(yīng)值與測定樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 方法精密度及儀器的穩(wěn)定性

以凱氏定氮法測定不含有其它氮源的鮮牛奶為標(biāo)準(zhǔn)，各測定6種牛奶的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。樣品6次重復(fù)測量的數(shù)據(jù)平行性較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD都小于1.0%，表明該分析方法的精密度較好，儀器的穩(wěn)定性或重現(xiàn)性較好。

表1 蛋白質(zhì)測定結(jié)果%

2.2.3 與凱氏定氮法比較及含氮物添加檢測實驗

向全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.47%的牛奶(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.21%)中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%和0.10%的外源無機物質(zhì)三聚氰胺氮、硫酸銨氮和尿素氮，及水解植物和動物蛋白等小分子多肽氮，結(jié)果如表2所示。

表2 添加含氮物后蛋白質(zhì)檢測實驗結(jié)果%

由表2可以看出，采用凱氏定氮法測定總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再推算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，會把添加的硫酸銨、尿素和三聚氰胺中含有的氮也計算成蛋白質(zhì)。對無外源含氮添加物時，牛奶快速檢測儀測得的結(jié)果同凱氏定氮法測的結(jié)果比較接近；表明蛋白質(zhì)快速檢測儀測定的結(jié)果則基本上可以真實的反應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而不受其他氮源添加物的影響，可以克服凱氏定氮法無法消除外源含氮添加物的影響。

3 結(jié)論

本研究是通過考馬斯亮藍進行改良，基于馬斯亮藍染色法的特性和牛奶中蛋白質(zhì)分子量的分布特征研制出牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀。分子量約1 ku以上含氮物中的肽鏈和考馬斯亮藍結(jié)合，在波長595 nm處達到最大吸收值。牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和清蛋白兩大類，它們的分子量大多在1×104～3×104u；蛋白質(zhì)分離檢測儀檢測的結(jié)果表明：牛奶中的蛋白質(zhì)分子量集中分布在1×104～7×104u，和考馬斯亮藍的顯色作用非常明顯，因此靈敏度很高。牛奶中的其他物質(zhì)，如脂肪、多糖、維生素等均不與考馬斯亮藍作用，摻假物質(zhì)，如三聚氰胺、尿素和硫酸銨等基本也不顯色，因此能有效識別；而水解植物和動物蛋白中，大部分是小分子肽，只有很少一部分的大分子蛋白質(zhì)才能顯色，但如果要達到和牛奶相同的顯色值，含氮量要達到牛奶的20倍左右才能做到，因此，用牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀測定蛋白質(zhì)，可有效地防止牛奶中摻假蛋白質(zhì)的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白的檢測問題，可用于現(xiàn)場牛奶真蛋白質(zhì)的快速檢測。

[1] 王淡兮,孫秀蘭.蛋白質(zhì)定量檢測方法的探討[J].糧食與食品工業(yè),2006,16(4).49-51.

[2] 張愛武.食品中蛋白質(zhì)測定方法的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2008 1:80-82.

[3] 李寧.幾種蛋白質(zhì)測定方法的比較[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,26(2):132-134.

[4] 路蘋,于同泉,王淑英，等.蛋白質(zhì)測定方法評價[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2006,21(4):65-68.

[5] 唐佳妮,呂元,劉東紅，等.國內(nèi)外乳品真蛋白檢測方法的進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(4):119-123.

[6] 李炳坤,陳春明.蛋白氮與非蛋白氮(三聚氰胺)的測定方法研究[J].江西化工,2009,(1):7-10.

[7] 顏輝,陳斌,朱文靜.近紅外光譜分析法快速檢測奶粉的品質(zhì)[J].中國乳品工業(yè),2009,37(3):49-52.

[8] 張智武，許建香.3種電泳方法定量分析牛奶蛋白的比較[J].中國乳品工業(yè),2005,33(8):51-54.

[9] 錢博.乳粉蛋白質(zhì)快速檢測方法的研究[D].碩士學(xué)位論文.浙江大學(xué),2006:9-14.

[10] 楊玉芳.蛋白質(zhì)含量測定方法[J].明膠科學(xué)與技術(shù),2007,27(2):98-101.

[11] 李博斌,曾金紅,鄭云峰，等.凝膠柱層析—考馬斯亮藍染色法鑒別釀造與非純釀造醬油的方法研究[J].中國釀造,2010,219(6):53-56.

Research on determination of protein in milk based on Gel filtration chromatography combined with Coomassie brilliant blue staining

ZHANG Hong1,LI Bo-bin1,ZENG Jin-hong1,FANG-Wei2,ZHENG Yun-feng1,MENG Yan-qing1,XIA Wei-fang1
（1．Shaoxing testing institute of quality and technical supervision,Shaoxing 312071,China；2．Hangzhou Tianchen Instrument Equipment Co.Ltd.,Hangzhou 310013,China）

The objective of this study was to develop a determination method for milk protein based on gel filtration chromatography combined with Coomassie brilliant blue staining,by which varieties of milks were detected and the detailed distribution characteristics of protein molecular weight was investigated in milk.Distribution characteristics was that the molecular weight was mostly concentrated in the(1-7)×104u,the proportion was small for those whose molecular weight was 7×104u or more,and 1×104u below,and combined with the features of Coomassie brilliant blue staining,the rapid detector of milk was developed.That rapid detector is small,fast,sensitive and easy to operate.Moreover,it can effectively eliminate the interference of protein detection in milk by the added inorganic nitrogen materials such as melamine,urea,ammonium sulfate,and small molecule peptide nitrogen materials such as hydrolyzed vegetable and animal proteins,which can fundamentally put an end to detection phenomenon of adulterated protein in milk.It can be used for rapid detection of true milk protein on the spot.

milk;protein;Gel filtration chromatography;Coomassie brilliant blue staining;rapid detector

TS252.7

A

1001-2230（2010）12-0041-04

2010-08-30

國家科技支撐計劃項目協(xié)作課題(ASJGG08-2)。

張弘(1964-)，男，高級工程師，從事機電類產(chǎn)品檢測及自動化研究工作。