核桃隔膜多糖的分離純化及單糖組成分析

高 莉，王 強，帕提古力·瑪合木提,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化性質(zhì)測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

核桃隔膜多糖的分離純化及單糖組成分析

高 莉1，王 強2，帕提古力·瑪合木提1,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化性質(zhì)測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

目的：分離純化核桃隔膜多糖并分析其單糖組成。方法：核桃隔膜經(jīng)水提醇沉、冷凍干燥得水溶性多糖，經(jīng)DEAE-纖維素52離子柱和SephadexG-100凝膠柱分離純化后得到多糖組分PDJL-A11(diaphragma ofjuglans regiaL. acid polysaccharide)。運用紫外光譜鑒定純度，氣相色譜分析多糖的單糖組成。結(jié)果：核桃隔膜多糖PDJL-A11單糖組成為：阿拉伯糖、果糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，其物質(zhì)的量比為2.11:6.52:8.81:12.59:15.58。結(jié)論：建立了核桃隔膜多糖分離純化的方法，確定了其單糖組成及其物質(zhì)的量比、可為核桃隔膜藥理學(xué)的研究提供參考。

核桃隔膜；多糖；純化；氣相色譜；單糖組成

Abstract：The purpose of this work was to isolate and purify polysaccharide from diaphragma ofJuglans regiaL (PDJL) and analyze its monosaccharide composition. A water-soluble crude polysaccharide was obtained by water extraction, ethanol precipitation and freeze-drying. The crude polysaccharide was purified to obtain a fraction of PDJL-A11 on DEAE-cellulose52 column and SephadexG-100 column. The purity of PDJL-A11 was analyzed by UV spectrophotometer. The monosaccharide composition and molecular ratio of PDJL-A11 were analyzed by gas chromatography. The monosaccharide composition of PDJLA11was composed of arabinose, fructose, mannose, rhamnose and glucose with a molar ratio of 2.11:6.52:8.81:12.59:15.58.

Key words：diaphragma ofJuglans regiaL.；polysaccharide；purification；gas chromatography；monosaccharide composition

核桃隔膜(diaphragma ofJuglans regiaL.)又名核桃分心木，為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物核桃的帶骨質(zhì)內(nèi)果皮的種隔[1]。在維吾爾族民間常用它泡服，具有補腎澀精、治療多汗、尿頻、遺尿、口腔潰瘍、牙齦出血等多重功效[2-3]。相關(guān)研究表明[4]，核桃隔膜中含有蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、有機酸、強心苷、甾類、皂苷等多種化學(xué)成分。而目前，對于其化學(xué)成分的研究僅限于黃酮、色素和揮發(fā)油。多糖作為一種重要的活性成分，除了有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老的生理功能外，還有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗凝血等作用[5-6]。

本實驗運用離子交換和凝膠層析對核桃隔膜多糖提取物分離純化，紫外光譜和凝膠層析鑒定純度，采用氣相色譜對PDJL-A11的單糖組分進行分析，以期為核桃隔膜多糖的結(jié)構(gòu)解析、構(gòu)效關(guān)系及生物活性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃隔膜(和田薄皮核桃)購于烏魯木齊市二道橋。

DEAE-cellulose52、SephadexG-100 Whatman公司；葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖 上海試劑公司；無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、氯化鈉、鹽酸、鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐、碳酸鋇、肌醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S24可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D循環(huán)水式真空泵、HH-S型水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司；D-37520離心機 德國Kendro公司；ALPHA1-2LD真空冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；HT6890氣相色譜儀 美國Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃隔膜粗多糖的提取

精確稱取100g經(jīng)過脫脂處理的核桃隔膜干粉，90%乙醇300mL在95℃提取2h，抽濾，濾渣揮干溶劑，按水料比1:80(m/V)、溫度90℃，水浴浸提180min，抽濾，濾渣可用少量溫水沖洗，得到核桃隔膜可溶性多糖浸提液。將多糖浸提液60℃真空濃縮成小體積，按體積比3:1加入Sevag混合液(氯仿與正丁醇體積比為4:1)，劇烈振蕩20min后，4000r/min離心15min，收集上清液，仍按體積比3:1加入Sevag混合液，重復(fù)10～13次至中間層無變性蛋白。收集上清液，加入3倍體積的無水乙醇置4℃冰箱過夜，5000r/min離心5min沉淀多糖，沉淀用乙醚和丙酮各洗滌兩次，真空冷凍干燥，稱質(zhì)量，備用。

1.3.2 核桃隔膜粗多糖的純化

1.3.2.1 DEAE-纖維素52柱層析[7-8]

柱規(guī)格為3cm×39.5cm，有效柱長15.5cm，50mg/mL糖液上樣6mL，采用0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫。控制流速0.5mL/min，5mL/管。蒽酮-硫酸法[9]隔管跟蹤檢測多糖流出部位，收集同一洗脫峰的多糖樣品，以管號為橫坐標，多糖洗脫液的吸光度為縱坐標，做洗脫曲線。

1.3.2.2 Sephadex G-100柱層析[10]

將DEAE-纖維素52柱層析洗脫組分經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥后配成20mg/mL溶液，上樣4mL，用0.1mol/L NaCl溶液洗脫，柱規(guī)格為2cm×40cm，有效柱長25.5cm，流速為0.2mL/min，3mL/管。蒽酮-硫酸法[9]隔管跟蹤檢測多糖流出部位，收集同一洗脫峰的多糖樣品，以管號為橫坐標，多糖洗脫液的吸光度為縱坐標，做洗脫曲線。

1.3.3 亞級組分PDJL-A11純度鑒定

1.3.3.1 SephadexG-100純度鑒定

經(jīng)過SephadexG-100分離純化后的亞級組分5mg溶解于0.1mol/L NaCl溶液中，上樣1mL，0.1mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.1mL/min，2mL/管。

1.3.3.2 紫外光譜純度鑒定

SephadexG-100分離純化后的亞級組分PDJL-A11，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥后配成0.5mg/mL溶液，在UV-2450紫外-可見分光光度計上從波長200nm掃描到600nm，蒸餾水作空白對照，檢測有無核酸(波長260nm處)和蛋白質(zhì)(波長280nm處)特征吸收峰。

1.3.4 單糖組成分析

1.3.4.1 樣品完全酸水解[11]

精確稱取20mg PDJL-A11置于安醅瓶中，加入2mol/L硫酸溶液5mL，酒精噴燈真空封管，置于烘箱里110℃水解6h，取出冷卻至室溫后加入BaCO3粉末靜置過夜，待其中和至中性，離心除去BaCO3沉淀，取上清液，冷凍干燥得到樣品單糖混合物，備用。

1.3.4.2 內(nèi)標肌醇六乙酸酯的制備[12]

稱取3g肌醇，加入4.5g鹽酸羥胺，45mL醋酸酐和3mL吡啶，在90℃水浴中加熱2h并不斷攪拌。將反應(yīng)液冷卻至室溫后倒入50mL冰水，使肌醇六乙酸酯析出。過濾后加20mL水洗滌，將壓干后產(chǎn)物放入100℃烘箱中烘干備用。制備的肌醇六乙酸酯用氣相色譜檢驗應(yīng)呈現(xiàn)單峰。

1.3.4.3 糖腈乙酰酯衍生物的制備

精確稱取水解后的樣品單糖混合物10mg，鹽酸羥胺10mg，內(nèi)標7mg，加入0.5mL吡啶，放入90℃水浴中加熱反應(yīng)30min并振蕩。取出冷卻至室溫，加入0.5mL醋酸酐，在90℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)30min進行乙酰化，取清液進行氣相色譜分析。標準單糖的糖腈乙酰酯衍生物采用同法制備。

1.3.4.4 氣相色譜條件

HT6890氣相色譜儀配備HP-5石英毛細管柱，F(xiàn)ID檢測器，程序升溫：柱初溫190℃，保留2min，以5℃/min升溫至230℃，保留5min；汽化室溫度：230℃；進樣量：1μL；分流比30:1；載氣N2：1mL/min；H2：30mL/min；空氣：300mL/min。

1.3.4.5 氣相色譜定性定量分析[13-14]

將樣品與標準單糖的色譜峰保留值進行對照以確定樣品中單糖的種類，采用內(nèi)標法根據(jù)內(nèi)標物和試樣的質(zhì)量以及內(nèi)標物和被測組分的峰面積求出樣品中單糖的含量及物質(zhì)的量比。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-纖維素52柱層析

由圖1可知，用水洗脫獲得了一種中性多糖組分，命名為PDJL-W。由圖2可知，NaCl溶液梯度洗脫出現(xiàn)了3種酸性多糖組分，按照出峰順序分別命名為PDJL-A1、PDJL-A2、PDJL-A3。由于其余組分含量較低，很難收集足夠的量進行后續(xù)研究，所以通過DEAE-纖維素52柱層析只對PDJL-A1組分進行下一步Sephadex G-100的分離純化。

圖1 核桃隔膜多糖DEAE-cellulose52柱層析水洗脫曲線圖Fig.1 Water elution curve of PDJL on DEAE-52 column

圖2 核桃隔膜多糖DEAE-cellulose52柱層析鹽洗脫曲線圖Fig.2 Salt elution curve of PDJL on DEAE-52 column

2.2 Sephadex G-100柱層析

圖3 核桃隔膜多糖PDJL-A1-Sephadex G-100柱層析鹽洗脫曲線Fig.3 Salt elution curve of PDJL-A1on Sephadex G-100 column

由圖3可知，在17管左右形成了一個明顯的主峰，但在此峰峰腰處即29管處出現(xiàn)了一個小峰。說明PDJL-A1中含有兩種分子質(zhì)量相差不太大的多糖組分，在凝膠柱上分離效果不好。為了能夠得到分子質(zhì)量比較均一的多糖，只收集1～27管洗脫液做后續(xù)研究，并將其命名為PDJL-A11。

2.3 核桃隔膜多糖PDJL-A11純度鑒定

2.3.1 Sephadex G-100純度鑒定

圖4 PDJL-A11的Sephadex G-100純度鑒定Fig.4 Purity identification of PDJL-A11on Sephadex G-100 column

將PDJL-A11溶解于0.1mol/L NaCl溶液中，通過Sephadex G-100層析柱洗脫得到了一個單一對稱峰。(圖4)說明通過分離純化得到的核桃隔膜酸性多糖PDJL-A11樣品是均一的純多糖，可以對其進行結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的研究。

2.3.2 紫外光譜純度鑒定

圖5 PDJL-A11的紫外-可見光譜圖Fig.5 UV-visible spectrum of PDJL-A11

如圖5所示，PDJL-A11的紫外光譜圖在紫外光區(qū)波長280nm處和可見光區(qū)沒有吸收峰，說明不含蛋白質(zhì)和色素，波長260nm處有一個較小的吸收峰，說明其組分含有少量核酸。

2.4 單糖組成分析

7種標準單糖糖腈乙?；苌锏腉C分析結(jié)果見表1，樣品單糖組成的GC分析結(jié)果見圖6。

表1 標準單糖糖腈乙?；苌锏腉C分析結(jié)果Table 1 GC analytical data of seven monosaccharide standards

圖6 樣品單糖組成的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram showing the monosaccharide composition of PDJL-A11

將樣品的氣相色譜圖與標準單糖氣相色譜圖進行對照，通過保留時間和峰面積對樣品中的單糖進行定性定量分析，結(jié)果見表2。由表2可以確定樣品PDJL-A11中含有葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖5種單糖，并計算得阿拉伯糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖的物質(zhì)的量之比為2.11:6.52:8.81:12.59:15.58。

表2 PDJL-A11的GC分析結(jié)果Table 2 GC analytical data of PDJL-A11

3 結(jié) 論

本研究采用DEAE-cellulose52陰離子交換樹脂和葡聚糖凝膠G-100層析柱從核桃隔膜中分離、純化得到了一種酸性多糖PDJL-A11。通過凝膠層析和紫外光譜分析，表明PDJL-A11為均一多糖組分。運用氣相色譜分析時，由于多糖本身不具有揮發(fā)性，所以選擇將其轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、對熱穩(wěn)定的糖腈乙酸酯衍生物。該法具有操作方便、定性簡單可靠、定量準確的優(yōu)點。

通過氣相分析，確定PDJL-A11由葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖5種單糖組成，并計算得出阿拉伯糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖的物質(zhì)的量之比為2.11:6.52:8.81:12.59:15.58。

[1] 郗容庭, 張毅萍. 中國核桃[M]. 北京:中國林業(yè)出版社, 1992:78-81.

[2] 菇克婭·沙德克. 維吾爾醫(yī)常藥材學(xué)(下冊)[M]. 烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社, 1993:53.

[3] 孫龍生. 核桃的經(jīng)濟價值[J]. 新農(nóng)業(yè), 2007(1):50.

[4] 王艷梅, 高莉, 帕提古麗·馬合木提, 等. 核桃隔膜化學(xué)成分定性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(12):123-124.

[5] 鄭敏, 盧葵花, 吳基良. 大蒜多糖體外抗乙型肝炎病毒作用研究[J].中藥藥理與臨床, 2005, 21(3):29-30.

[6] 鄭敏, 梅賢臣, 鮑翠玉. 大蒜多糖體外抗柯薩奇病毒B作用[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2005, 22(1):4-6.

[7] 吳茜茜, 吳克. 海帶巖藻多糖的分離與部分性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2001, 27(10):39-42.

[8] 孔慶勝, 王彥英. 南瓜多糖的分離、純化及其降血脂作用[J]. 中國生化藥物雜志, 2000, 21(3):130-132.

[9] 張翼伸. 食品分析[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 1983:163.

[10] 趙永芳. 生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用[M]. 武漢:武漢大學(xué)出版社,1999:113-146.

[11] 李健, 劉寧, 陳平, 等. 香菇多糖單糖組成及含量的測定方法研究[J].化學(xué)與黏合, 2005, 27(2):71-73.

[12] 張惟杰. 復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M]. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1987:41-43.

[13] 沈萍萍, 付庭治. 真菌多糖研究進展[J]. 南京大學(xué)學(xué)報, 1991, 27(3):524-529.

[14] 朱明華. 儀器分析[M]. 3版. 北京:高等教育出版社, 2000:52-54.

Isolation, Purification and Monosaccharide Composition Analysis of Polysaccharide from Diaphragma ofJuglans regiaL.

GAO Li1，WANG Qiang2，PATIGUL Mahmut1,*
(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University,rmqi 830046, China；2. Test Center of Physical and Chemical Characteristic, Xinjiang University,rmqi 830046, China)

TS201.23

A

1002-6630(2010)21-0182-04

2010-02-06

高莉(1984—)，女，碩士，主要從事資源植物成分分析研究。E-mail：gaoli40130@163.com

*通信作者：帕提古力·瑪合木提(1959—)，女，教授，本科，主要從事資源植物成分研究。E-mail：patigulimahemuti@126.com