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      凱氏定氮法測(cè)定魚蛋白質(zhì)含量的干擾因素分析

      2010-10-19 05:25:08魯健章孫麗華周彥鋼
      食品科學(xué) 2010年19期
      關(guān)鍵詞:凱氏定氮態(tài)氮魚肉

      魯健章,孫麗華,周彥鋼*

      (浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所,浙江 杭州 310013)

      凱氏定氮法測(cè)定魚蛋白質(zhì)含量的干擾因素分析

      魯健章,孫麗華,周彥鋼*

      (浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所,浙江 杭州 310013)

      為了使凱氏定氮法更適于魚蛋白質(zhì)含量測(cè)定,針對(duì)魚肉中非氨基酸態(tài)氮和魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)進(jìn)行分析,并探討凱氏定氮法測(cè)定魚蛋白質(zhì)的可行的改進(jìn)措施。

      凱氏定氮法;魚蛋白;氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù);非氨基酸態(tài)氮

      Abstract:In order to improve the accuracy of Kjeldahl method for the determination of fish protein, the conversion factor between amino acid nitrogen and non-amino acid nitrogen in fish protein is analyzed and a series of feasible improvement strategies for the determination of fish protein by Kjeldahl method are discussed in this paper.

      Key words:Kjeldahl determination;fish protein;conversion factor;non-amino acid nitrogen

      凱氏定氮法是目前使用最為廣泛、經(jīng)典的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法,也是蛋白質(zhì)檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法操作簡(jiǎn)單,測(cè)定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性好,廣泛應(yīng)用于各種食品、飼料、水產(chǎn)等行業(yè)的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。蛋白質(zhì)中含有一定比例的氮元素,氮元素含量與蛋白質(zhì)的含量存在一定的轉(zhuǎn)換關(guān)系,即氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù),F(xiàn)[1]。凱氏定氮法首先測(cè)定樣品中氮的質(zhì)量,再乘以F值即為樣品中的蛋白質(zhì)質(zhì)量。

      通常情況下,蛋白質(zhì)含氮量在16%左右,其F值為6.25。但是,實(shí)際上不同來(lái)源的蛋白質(zhì)的氨基酸組成差別很大,含氮量的差別也很大,如乳制品、面粉、花生的蛋白質(zhì)含氮量分別為15.67%、17.54% 和18.32%,則它們的F值分別為6.38、5.70和5.46[1]。對(duì)于魚類蛋白而言,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沒有列出其F值,研究人員普遍引用肉及肉制品的F值(6.25)來(lái)計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。但作者在研究魚肉蛋白過(guò)程中多次發(fā)現(xiàn),按此系數(shù)計(jì)算所得的蛋白質(zhì)含量常常遠(yuǎn)高于魚肉酸水解氨基酸的總量,魚蛋白粉的蛋白含量測(cè)定結(jié)果往往超過(guò)100%。最初作者認(rèn)為誤差源自不準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)系數(shù)(6.25),所以在現(xiàn)有的文獻(xiàn)基礎(chǔ)上計(jì)算了魚肉蛋白含氮量并推導(dǎo)了F值,結(jié)果顯示魚肉蛋白含氮量在14%左右,絕大部分魚蛋白的真實(shí)F值在7.0~7.5之間。然而如果根據(jù)此系數(shù)計(jì)算魚肉蛋白質(zhì)含量則勢(shì)必造成計(jì)算結(jié)果更大的偏離。經(jīng)初步分析,筆者判斷該誤差源自魚肉中存在的非氨基酸態(tài)氮(non-amino acid nitrogen,NAN),如氧化三甲胺及其分解產(chǎn)物、尿素、生物堿等,它們的存在虛高了魚肉的蛋白質(zhì)含量。

      為了使凱氏定氮法能夠準(zhǔn)確的測(cè)定魚肉及魚肉制品中的蛋白質(zhì)含量,并客觀、真實(shí)的評(píng)價(jià)魚蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,本文針對(duì)氮換算蛋白質(zhì)系數(shù)和如何去除魚肉中非氨基酸態(tài)氮的干擾進(jìn)行研究,并探討可行的改進(jìn)措施。

      1 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理

      蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后,以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定,根據(jù)酸消耗量乘以換算系數(shù),即為蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量的計(jì)算公式如式(1)、(2)。

      式中:w為試樣中蛋白質(zhì)的含量/(g/100g);w1為試樣中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%;V1為試樣消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL;V2為試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL;V3為試樣消化液的定容體積/mL;V4為堿化蒸餾的試樣消化液體積/mL;c為硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度/(mol/L);0.0140為1.0mL硫酸(c(1/2 H2SO4)=1mol/L)或鹽酸(c(HCl)=1mol/L)標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量/g;m為試樣的質(zhì)量/g或體積/mL;F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù):一般食物為6.25,乳制品為6.38,面粉為5.70,玉米、高粱為6.24,花生為5.46,米為5.95,大豆及其制品為5.71,肉與肉制品為6.25,大米、小米、燕麥、裸麥為5.83,芝麻、向日葵為5.30。F值計(jì)算方法見公式(3)和(4)[2]。

      式中:N表示蛋白質(zhì)中總氮含量/%;F表示氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù);C表示樣品中各氨基酸的百分含量/%;n表示氨基酸分子中所含氮原子數(shù);W表示氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量;14表示氮原子的相對(duì)原子質(zhì)量;i取值1到18,表示計(jì)算蛋白質(zhì)氮含量所統(tǒng)計(jì)的18種氨基酸。

      由式(2)可知,試樣蛋白質(zhì)含量測(cè)定值是否準(zhǔn)確只與兩個(gè)因素相關(guān),即試樣氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w1)和氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)(F)。如要采用凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)定試樣的真實(shí)蛋白質(zhì)含量,則必須已知正確的F值并測(cè)定得出試樣真實(shí)的蛋白質(zhì)的氮含量(排除非蛋白質(zhì)氮干擾)。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和水產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定蛋白質(zhì)的方法(凱氏定氮法)中都沒有專門為魚類明確標(biāo)示氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù),研究人員和水產(chǎn)行業(yè)相關(guān)從業(yè)人員普遍采用肉與肉制品的換算系數(shù)(6.25)。為了改進(jìn)測(cè)定魚及魚肉制品蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法,有必要針對(duì)蛋白質(zhì)換算系數(shù)和如何去除魚肉中非氨基酸態(tài)氮的干擾展開深入的探討。

      2 凱氏定氮法在魚蛋白測(cè)定中遇到的問(wèn)題分析

      2.1 魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)

      基于文獻(xiàn)報(bào)道的40種魚類的肌肉氨基酸分析結(jié)果[3-36],按照公式(3)計(jì)算得到了40種魚類的氨基酸態(tài)氮(aminoacid nitrogen,AN)含量,根據(jù)公式(4)推導(dǎo)出了40種魚類的F值(表1)。由表1可見,40種魚的F值均高于目前常采用的6.25,除淡水魚魴、羅非魚和瓣結(jié)魚F值在6.7左右,淡水石首魚F值為7.9外,絕大部分魚類的F值在7.0~7.5之間。

      表1 40種常見經(jīng)濟(jì)魚類氨基酸含氮量及換算系數(shù)Table 1 Amino acid nitrogen and conversion factors in 40 species of commercial fish

      表2 鯔魚不同部位和軍曹魚不同生長(zhǎng)階段氨基酸態(tài)氮含量和換算系數(shù)比較Table 2 Comparisons on amino acid nitrogen and conversion factors in differentMugil cephalustissues and the growth period ofRachycent ron canadumLinnaeus

      表3 魚類不同性別及生長(zhǎng)方式氨基酸態(tài)氮含量和換算系數(shù)比較Table 3 Comparisons on amino acid nitrogen and conversion factor for different genders and growth styles of fish

      表4 10種海水魚[25]肌肉和卵的氨基酸態(tài)氮含量和換算系數(shù)Table 4 Comparisons on amino acid nitrogen and conversion factor of muscle and egg in 10 species of marine fish

      表2和表3統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,鯔魚不同部位、軍曹魚不同生長(zhǎng)階段以及文昌魚不同性別對(duì)氨基酸態(tài)氮含量(AN)的影響很小,F(xiàn)值變異系數(shù)均小于1%;3種海水魚(黃顙魚、石斑魚、鯔魚)在不同生長(zhǎng)方式(野生/飼養(yǎng))下氨基酸態(tài)氮含量的變異系數(shù)均小于1.5%。表4所示的絕大部分海水魚的肌肉和卵的氨基酸態(tài)氮含量的變異系數(shù)小于1.5%。由此可見,同一種屬魚類的不同性別、不同部位、不同組織、不同生長(zhǎng)階段、不同生長(zhǎng)方式以及肌肉與卵的氨基酸態(tài)氮含量的變異程度很小,F(xiàn)值非常接近。由此初步推斷,同一種屬魚類的F值相對(duì)固定,在凱氏定氮法測(cè)定魚類蛋白質(zhì)含量時(shí),同種屬魚類采用相同氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)是可行的。

      2.2 魚類非氨基酸態(tài)氮含量(NAN)分析

      如上所述,非氨基酸態(tài)氮是凱氏定氮法測(cè)定魚蛋白質(zhì)的另一主要干擾因素。從表5和表6統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可見,魚類的非氨基酸態(tài)氮含量(NAN)差異巨大。30種不同種屬的魚類(海水魚類和淡水魚類)的非氨基酸態(tài)氮的含量差別在2%~30%,并且同一種屬魚類的非氨基酸態(tài)氮含量的變異性也很大(變異系數(shù)多在50%左右)。雖然統(tǒng)計(jì)樣本量有限,但是由表6可以看出,同一種屬魚類所處不同育成方式(野生/飼養(yǎng))其非氨基酸態(tài)氮含量也會(huì)產(chǎn)生明顯差別;鯔魚不同部位的非氨基酸態(tài)氮含量差別很大;雌雄文昌魚非氨基酸態(tài)氮含量也有差別。

      表5 30種魚類非氨基酸態(tài)氮含量比較Table 5 Comparisons on non-amino acid nitrogen in 30 species of fish

      表6 魚類不同性別、不同育成方式及不同部位的非氨基酸態(tài)氮含量比較Table 6 Comparison of non-amino acid nitrogen in different genders,growth styles and tissues of fish

      鮮活魚類的非氨基酸態(tài)氮主要是肌肉內(nèi)的氧化三甲胺、尿素、嘌呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜堿類化合物。魚死后貯藏過(guò)程中在微生物和酶的作用下還會(huì)分解蛋白質(zhì),產(chǎn)生小分子的氨及胺類化合物使魚體的非氨基酸態(tài)氮含量升高,其生成量與魚體的腐敗程度有相關(guān)性[37]。由上述分析可得出一個(gè)結(jié)論:不同種屬魚類,或同種屬的魚類(海水魚類或者淡水魚類),其非氨基酸態(tài)氮含量都存在巨大差異。特別是,魚類還會(huì)因?yàn)橘A藏過(guò)程而導(dǎo)致魚體非氨基酸態(tài)氮的含量差異。魚類非氨基酸態(tài)氮含量的不確定性為魚肉蛋白質(zhì)含量測(cè)定帶來(lái)了一定的困難。如果要采用凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)定魚肉蛋白質(zhì)含量,則首先要排除非氨基酸態(tài)氮的干擾。

      3 改進(jìn)措施的探討

      鮮活魚類的非氨基酸態(tài)氮(氧化三甲胺、尿素、嘌呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜堿類化合物)和魚死后貯藏過(guò)程中在微生物和酶的作用下產(chǎn)生的氨及胺類化合物具有揮發(fā)性,可采用揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定方法(GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[38])由凱氏定氮裝置在堿性溶液中將這類堿性含氮物質(zhì)蒸餾出來(lái),以硼酸溶液回收。回收的非氨基酸態(tài)氮含量采用凱氏定氮的方法測(cè)定,計(jì)算非氨基酸態(tài)氮的含量。

      因此,可行的凱氏定氮法測(cè)定魚類蛋白質(zhì)含量的公式為:

      式中:w為試樣中蛋白質(zhì)的含量/%;w1為試樣中總氮的含量/%;w2為試樣中非氨基酸態(tài)氮的含量/%;F為已知的某種魚類的氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)。

      4 結(jié) 論

      通過(guò)對(duì)30種魚類中非氨基酸態(tài)氮含量的分析,證實(shí)非氨基酸態(tài)氮是凱氏定氮法測(cè)定魚蛋白質(zhì)含量的主要干擾因素。通過(guò)對(duì)40種魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前所普遍采用的F值(6.25)與其真實(shí)F值(7.0~7.5)相差很大,這給氮換算魚蛋白質(zhì)含量時(shí)帶來(lái)了一定的誤差。本文還簡(jiǎn)述了采用揮發(fā)性鹽基氮檢測(cè)方法測(cè)定魚肉中非氨基酸態(tài)氮的措施:在測(cè)定的總氮數(shù)值基礎(chǔ)上扣除其非氨基酸態(tài)氮含量,再以真實(shí)F值換算魚蛋白質(zhì)含量,測(cè)定結(jié)果將更加可靠。

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      Interference Factors of Protein Determination in Fish using Kjeldahl Method

      LU Jian-zhang,SUN Li-hua,ZHOU Yan-gang*
      (Institute of Health Food, Zhejiang Academy of Medical Science, Hangzhou 310013, China)

      TS254.7

      A

      1002-6630(2010)19-0453-04

      2010-01-14

      浙江省科技廳重大項(xiàng)目(2007F10031)

      魯健章(1981—),男,助理研究員,博士研究生,主要從事食品科學(xué)與工程研究。E-mail:lujianzhang@yahoo.cn

      *通信作者:周彥鋼(1955—),男,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,主要從事保健食品研究與開發(fā)。E-mail:zyg195588@yahoo.cn

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