星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選短梗五加葉中金絲桃苷的提取工藝

陸 珞，關(guān) 鍵，蔡恩博，徐 蕊，徐春玲，徐海金，鄭友蘭*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選短梗五加葉中金絲桃苷的提取工藝

陸 珞，關(guān) 鍵，蔡恩博，徐 蕊，徐春玲，徐海金，鄭友蘭*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

目的：星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選短梗五加葉中金絲桃苷的提取工藝。方法：以乙醇體積分數(shù)、提取時間、溶媒比為主要影響因素，金絲桃苷提取率為評價指標，通過對主要因素各水平的多元線性回歸及二項式擬合，用嶺嵴分析和效應(yīng)面法選取最佳工藝，并進行預(yù)測分析。 結(jié)果：確定金絲桃苷最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)69.80%，溶媒比23.17，超聲提取時間86.56min。結(jié)論：星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選的短梗五加葉中金絲桃苷的提取工藝，方法簡便，精密度高。

短梗五加；星點設(shè)計；效應(yīng)面法；金絲桃苷；工藝優(yōu)化

Abstract：Objective:To develop an optimal process for hyperin extraction fromAcanthopana sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)leaves. Methods:The major factors affecting hyperin extraction yield were ethanol concentration, extraction time and liquid-tosolid ratio. They were optimized using central composite design and response surface methodology. Multiple linear regression and quadratic polynomial fitting of experimental data obtained from central composite design were carried out to set up a mathematical model with hyperin extraction yield as a function of the above factors. Their optimal values were chosen using ridge analysis and verified experimentally. Results:The optimal conditions for the extraction of hyperin were found to be:ethanol concentration 69.80%, liquid-to-solid ratio 23.17:1 and extraction time 86.56 min. Conclusion:Central composite design and response surface methodology are suitable for optimizing the extraction of hyperin fromAcanthopana sessiliflorusleaves.This method is simple, convenient and accurate.

Key words：Acanthopanax sessiliflorus；central composite design；response surface methodology；hyperin；optimization

短梗五加[Acanthopanax sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)Seem.]為五加科五加屬植物，分布于東北、華北、陜西等地[1]。性溫，味辛，無毒，具滋補強壯、祛風(fēng)除濕等功效[2]。其根皮為我國傳統(tǒng)中藥，其莖﹑葉也可作藥用。一直以來，短梗五加是遼東山區(qū)特有的藥膳兩用植物，其嫩莖和葉可做蔬菜或制茶，市場上已開發(fā)出短梗五加苦茶，具有減肥、降血糖、鎮(zhèn)靜安神之功效。本研究通過試驗檢測出短梗五加葉內(nèi)含有金絲桃苷，且含量較大?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明金絲桃苷具有良好的治療慢性氣管炎、哮喘的作用，并對缺血性腦損傷有很好的保護作用[3-5]，因此把金絲桃苷作為衡量短梗五加葉質(zhì)量的重要指標。本實驗以短梗五加葉中金絲桃苷含量的提取率為指標，對其采取歸一化法處理，優(yōu)選出合理的短梗五加葉提取條件，為進一步開發(fā)短梗五加相關(guān)的產(chǎn)品提供依據(jù)。星點設(shè)計(central composite design，CCD) 是國外近年常用的實驗優(yōu)化方法，具有可采用非線性擬合的特點，其結(jié)果可采用集數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)方法于一體的效應(yīng)面法進行優(yōu)化[6]，能準確找到較佳的工藝參數(shù)。本實驗應(yīng)用星點設(shè)計-效應(yīng)面法即采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，在中心點進行重復(fù)性實驗以提高實驗精度，預(yù)測值更接近真實值，且實驗次數(shù)也較少[7]，從而優(yōu)選出短梗五加葉中金絲桃苷的最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短梗五加葉采集于吉林省臨江市老嶺基地，經(jīng)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院胡全德教授鑒定為短梗五加[Acanthopanax sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)Seem]樣品。

金絲桃苷對照品 中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)；雙蒸水(經(jīng)微孔濾膜濾過)；冰醋酸(分析純)、乙醇(分析純) 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

ALLTECH高效液相色譜儀；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；電子天平(500g/0.001g) 金羊天平儀器廠；百靈LA114型電子天平(110g/0.0001g) 常熟市百靈天平儀器有限公司；101-2型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海錦屏儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金絲桃苷含量測定方法的建立

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：ODS-C18(4.6mm×250mm，5μm)；檢測波長：360nm；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液(55:45，V/V)；體積流量：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長360nm；進樣量10μL。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

取干燥至質(zhì)量恒定的短梗五加葉粗粉約1.0g，精密稱量，置于錐形瓶中，精密加入一定體積分數(shù)的乙醇30mL，密封稱量溶液總體質(zhì)量并記錄，浸泡過夜，超聲提取，靜置至室溫，用乙醇補足溶液總體質(zhì)量，提取液過濾，蒸干，精密加入20mL甲醇將殘渣完全溶解，用孔徑為0.45μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.3.1.3 對照品溶液的制備

精確稱取金絲桃苷對照品2.000mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的金絲桃苷對照品溶液。

1.3.1.4 標準曲線的繪制

吸取上述對照品溶液，分別進樣2、4、8、12、16μL，按上述色譜條件進行HPLC分析，以峰面積和進樣量進行線性回歸，金絲桃苷線性方程為Y=1481576.6311X－138220.1402(R2=0.9997，n=5)，線性范圍0.4～3.2μg。其中Y是峰面積，X為進樣體積。

1.3.1.5 重現(xiàn)性實驗

取短梗五加葉樣品，按照1.3.1.2節(jié)的方法，重復(fù)制備5份供試品溶液，分別測定，結(jié)果金絲桃苷金絲桃苷峰面積的RSD(相對標準偏差)為1.95%，表明方法重復(fù)性良好。

1.3.1.6 精密度實驗

取短梗五加葉樣品，制備供試品溶液，連續(xù)進樣5次，結(jié)果金絲桃苷峰面積的RSD為1.46%。表明儀器精密度良好。

1.3.1.7 穩(wěn)定性實驗

取短梗五加葉樣品，制備供試品溶液，分別于1、2、3、4、5h進樣，結(jié)果金絲桃苷峰面積的RSD為1.63%。表明供試品溶液在5h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.1.8 加標回收率實驗

精密稱取短梗五加葉粉末樣品1.000g，平行5份，加入一定量的金絲桃苷對照品，制備供試品溶液，進行測定，計算得金絲桃苷平均回收率為98.45%，RSD為1.48%。

1.3.1.9 樣品測定

將樣品供試液在1.3.1.1節(jié)選定的色譜條件下進行分析，將其峰面積代入相應(yīng)的回歸方程，并按以下公式計算金絲桃苷的提取率。

1.3.2 試驗選擇提取因素及相關(guān)水平

1.3.2.1 乙醇體積分數(shù)范圍的選擇

[6]，當每次提取90min，加10倍量的溶劑，比較體積分數(shù)0、30%、50%、70%、90%乙醇對指標值的影響，結(jié)果顯示以水為溶劑對金絲桃苷的提取率偏低，以體積分數(shù)大于30%的乙醇為溶劑對指標值能達到較好的提取效果，所以選擇乙醇體積分數(shù)的下限為30%、上限為90%。

1.3.2.2 提取時間范圍的選擇

本實驗采用超聲提取的方法，超聲功率80W、提取溫度為30℃、提取時間范圍確定為10～90min以確定佳提取時間。

1.3.2.3 溶媒比范圍的選擇

根據(jù)經(jīng)驗在中藥提取中，溶媒比一般為15倍左右，如果溶劑量太少，浸泡過夜后被藥材吸收，導(dǎo)致無法過濾，而溶劑量太大，試劑消耗過大，則需要更大的經(jīng)濟投入，所以溶媒比選擇范圍為12～30倍。

1.3.3 星點設(shè)計

表1 星點設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels in the central composite design

各因素水平設(shè)計見表1，按星點設(shè)計方法安排試驗，共17組(表2)，分別標號為S1～S17。取干燥至質(zhì)量恒定的短梗五加葉粗粉約1.0g，精密稱定，平行17份，于錐形瓶中按表2處理，提取3次，合并備用，溶液用孔徑為0.45μm濾膜濾過。

為了精確考察最佳因素水平值，選取乙醇體積分數(shù)(X1)、提取時間(X2)和溶媒比(X3)為自變量，以金絲桃苷提取率(Y)為因變量，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面方法設(shè)計試驗，并用SAS 9.2軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行RSREG分析，RSREG過程(二次響應(yīng)面回歸過程)用于擬合完全二次響應(yīng)曲面的回歸模型[8]。通過分析研究，擬合出曲面形狀的最佳響應(yīng)的因子水平或范圍。這里，Y為響應(yīng)變量，X1、X2、X3為因子變量，二次響應(yīng)曲面回歸模型為：

RSREG過程具有以下功能：1)模型擬合及對參數(shù)估計做方差分析；2)為了調(diào)查預(yù)測響應(yīng)曲面的形狀而進行典型性相關(guān)分析；3)為了尋找最佳響應(yīng)的范圍而進行嶺嵴分析，由此可以精確得出最佳響應(yīng)值時各因子的取值，同時，還可以以指標值為縱坐標，固定3個自變量之一為所估計的最佳值上，其他兩個自變量為橫坐標，用Origin 8.0繪制三維效應(yīng)面(response surface)圖。由圖中的指標值選取最佳自變量值，最后用效應(yīng)面法得出的最佳工藝條件提取藥材，并依據(jù)模型進行預(yù)測分析，進行驗證試驗，最終得到優(yōu)化的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 星點試驗結(jié)果

星點試驗結(jié)果見表2。

表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

2.2 二次響應(yīng)面回歸分析結(jié)果

應(yīng)用SAS 9.2軟件包對試驗數(shù)據(jù)進行二次響應(yīng)面回歸分析，得到的完全二次響應(yīng)曲面的回歸模型為：

R=0.896，擬合不足檢驗概率P=0.071。

由于這個回歸模型的相關(guān)系數(shù)均較大，且擬合不足檢驗概率均大于0.05，說明模型較優(yōu)。通過嶺嵴分析，得出回歸模型的最佳響應(yīng)點為金絲桃苷(Ymax)=0.1338(X1=69.80，X2=86.56，X3=23.17)。

2.3 效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝和預(yù)測

根據(jù)擬合的二次回歸方程，用Origin 8.0繪制三維效應(yīng)面圖(圖1)，從圖1可以直觀看出，金絲桃苷收率較高的提取工藝范圍為：X1：50%～65%，X2：70～90min，X3：26～30。

根據(jù)確定的最優(yōu)提取工藝，分別取3份樣品，進行驗證實驗，并將測定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值進行比較，并計算其相對偏差。

驗證實驗測定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值相對偏差分別為1.11%、1.38%，證明該方法可靠。

3 討 論

3.1 本實驗采用了星點設(shè)計，除了充分考慮到各因素間的相互作用外，且設(shè)計方法簡單、實驗次數(shù)少。在中心點進行重現(xiàn)性實驗，以提高實驗精度。同時采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，可信度較好，預(yù)測值更接近真實值，星點設(shè)計實驗所得的信息量更大、更直觀，更適合于探索性的試驗研究。

3.2 目前國內(nèi)關(guān)于短梗五加葉金絲桃苷含量測定的文獻較少，本實驗采用高效液相法測定短梗五加葉中金絲桃苷的含量，測定結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好，雜質(zhì)干擾小，是一種較理想的含量測定方法。同時，高效液相法所測得的短梗五加葉中金絲桃苷的含量較大，因此本實驗可為金絲桃苷作為衡量短梗五加葉質(zhì)量的重要指標提供參考依據(jù)。

3.3 將乙醇的體積分數(shù)、提取時間、溶媒比作為短梗五加葉中金絲桃苷提取率的主要因素，在試驗設(shè)計中，各因素間往往相互影響，所以不能只考慮單個因素的影響。為了避免乙醇的體積分數(shù)、提取時間和溶媒比這3個因素間的交互作用對金絲桃苷提取率的影響，本實驗采用星點設(shè)計法綜合考慮3因素間的交互作用，并通過效應(yīng)面法分析得出最佳的提取條件。由實驗結(jié)果知，采用23.17倍量69.80%乙醇超聲提取86.56min，短梗五加葉中金絲桃苷提取率能達到90%以上。短梗五加資源主要集中于遼東地區(qū)，但在大連市、北京市、湖北省、上海市等地均有引種栽培，其莖、葉、果在民間有悠久的食用習(xí)俗[9]，使用短梗五加葉制成的苦茶具有良好的保健作用，并深受消費者歡迎，通過查閱文獻得知，金絲桃苷在臨床上對許多疾病有顯著的療效[10]。而通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選出的工藝可最大化地提取出短梗五加葉中的，為廣泛地開發(fā)金絲桃苷產(chǎn)品提供一定參考。

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Optimizing Hyperin Extraction fromAcanthopana sessiliflorusLeaves Using Central Composite Design and Response Surface Methodology

LU Luo，GUAN Jian，CAI En-bo，XU Rui，XU Chun-ling，XU Hai-jin，ZHENG You-lan*
(College of Chinese Medicinal Material, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)18-0046-04

2009-12-14

陸珞(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為新藥及其開發(fā)。E-mail：luluo04@163.com

*通信作者：鄭友蘭(1956—)，女，教授，學(xué)士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：caienbo8251@163.com