離子交換樹(shù)脂分離谷胱甘肽洗脫液的脫鹽研究

李從軍，謝愛(ài)娣

(1.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430068)

離子交換樹(shù)脂分離谷胱甘肽洗脫液的脫鹽研究

李從軍1，謝愛(ài)娣2

(1.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430068)

為提高離子交換樹(shù)脂法分離純化谷胱甘肽的產(chǎn)品質(zhì)量，采用大孔吸附樹(shù)脂SP-207對(duì)732強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂分離酵母提取液中谷胱甘肽的洗脫液進(jìn)行脫鹽效果研究。在優(yōu)化的條件下，脫鹽率達(dá)到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，說(shuō)明大孔樹(shù)脂SP-207用于脫鹽效果非常理想。

谷胱甘肽；脫鹽；大孔吸附樹(shù)脂

Abstract：To improve the quality of glutathione purified with 732 type ion-exchange resin column, SP-207 type macroporous adsorption resin was used to desalinate the pooled glutathione-containing eluate. Under optimized conditions, the desalinization ratio was 99.86% and the recovery rate of glutathione was 65.71%. SP-207 type macroporous resin adsorption is a good choice for desalination.

Key words：glutathione；desalination；macroporous adsorption resin

還原型谷胱甘肽(GSH)是一種廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物細(xì)胞中的具有重要生理功能的活性三肽[1]。谷胱甘肽作為細(xì)胞內(nèi)唯一的含巰基的三肽在細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用[2]，在食品工業(yè)、醫(yī)藥臨床和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)得到廣泛的應(yīng)用。目前谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有萃取法、發(fā)酵法、酶法和化學(xué)合成法[3]。由于微生物發(fā)酵法與其他方法相比具有明顯的優(yōu)越性，是今后生產(chǎn)谷胱甘肽的主要趨勢(shì)，也是目前為止最具潛力的方法。目前報(bào)道的分離純化谷胱甘肽的方法主要有銅鹽法、樹(shù)脂法、電滲析法和雙水相法4種[4-7]。樹(shù)脂法相對(duì)其他方法經(jīng)濟(jì)效益較高，也是國(guó)外廣泛采用的方法。其中，離子交換樹(shù)脂法已有多篇專利和文獻(xiàn)報(bào)道[5,8-11]。但是，由于酵母提取液本身含有一些鹽分，且離子交換樹(shù)脂分離谷胱甘肽一般采取增強(qiáng)離子強(qiáng)度洗脫，洗脫液中也將會(huì)含有大量的鹽，為后續(xù)處理帶來(lái)麻煩、影響產(chǎn)品質(zhì)量，所以必須進(jìn)行脫鹽處理。大孔吸附樹(shù)脂是一類不同于離子交換樹(shù)脂的吸附和篩選性能相結(jié)合的分離材料，它是分離有機(jī)化合物尤其是水溶性化合物的有效手段。對(duì)有機(jī)物的選擇性良好，無(wú)機(jī)鹽的存在非但不干擾吸附反而有利于吸附[12]。本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)離子交換洗脫液進(jìn)行脫鹽，研究其脫鹽條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：葡萄糖50g/L、酵母粉5g/L、KH2PO42g/L、MgSO41g/L、pH值自然。121℃滅菌30min，培養(yǎng)溫度25～28℃，搖床轉(zhuǎn)速150～180r/min。

732強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 安徽三星樹(shù)脂科技有限公司；大孔吸附樹(shù)脂SP-207 日本三菱化學(xué)公司。

GSH標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) Sigma公司；硝酸銀、鉻酸鉀、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(簡(jiǎn)稱DTNB)、亞硝基鐵氰化鈉、Tris、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉(均為國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

BSZ-100自動(dòng)部分收集器、HL-2恒流泵、層析柱(φ2.6cm×20cm) 上海滬西分析儀器廠；UNICO UV-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼卡公司；恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠；控溫?fù)u床 中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；微量移液槍 美國(guó)熱電公司；Anke TGL-16G高速冷凍離心機(jī) 上海飛鴿公司；Mettler AE100分析天平 Mettler公司。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定方法

谷胱甘肽：采用DTNB法測(cè)定[13]；鹽濃度測(cè)定方法：以Cl－濃度表示，采用莫爾法測(cè)定[14]；洗脫終點(diǎn)判斷：采用亞硝基鐵氰化鈉檢測(cè)法[15]，觀察其顏色變化，若顏色變?yōu)榧t色，表明洗脫液中有還原型谷胱甘肽存在，否則，表明洗脫液中無(wú)還原型谷胱甘肽存在。

1.3.2 樹(shù)脂預(yù)處理方法

732強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：取一定量的樹(shù)脂，用自來(lái)水反洗除去機(jī)械雜質(zhì)(約3～5次)，用一定濃度的NaOH溶液洗出雜質(zhì)(約泡2h)，用去離子水洗至中性，再用一定濃度的HC1溶液轉(zhuǎn)型(約浸泡2h)，再用去離子水洗至中性，抽濾，置于具塞試劑瓶中，待用。

大孔吸附樹(shù)脂SP-207：通過(guò)乙醇(或甲醇)與水交替反復(fù)洗脫，可除去樹(shù)脂中的殘留物，一般洗脫劑用量為樹(shù)脂體積的2～3倍，交替洗脫2～3次，最終以水洗脫，保持分離使用前的狀態(tài)。使用甲醇、丙酮、或酸堿、水的反復(fù)再生處理，即可恢復(fù)樹(shù)脂的吸附能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換洗脫液制備

2.1.1 含谷胱甘肽酵母提取液制備

由斜面挑取一環(huán)菌種接種于裝液量30mL的錐形瓶，28℃、200r/min培養(yǎng)2d后接種于裝液量500mL錐形瓶，相同條件培養(yǎng)4d后收獲菌體。采用熱水抽提法[16]進(jìn)行提取，得含谷胱甘肽的酵母提取液。

2.1.2 離子交換分離谷胱甘肽洗脫液的制備

80g樹(shù)脂裝入φ2.6cm×20cm層析柱，800mL酵母提取液(谷胱甘肽含量342.21mg/L)用鹽酸調(diào)pH3.0左右，以0.5柱床體積/小時(shí)(BV/h)上柱吸附再以1BV水洗柱然后用1.0mol/L鹽酸1.0BV/h洗脫，至采用亞硝基鐵氰化鈉檢測(cè)法顏色變?yōu)闊o(wú)色，洗脫達(dá)到終點(diǎn)。洗脫液用氫氧化鈉中和至pH2.0～3.0。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂SP-207脫鹽研究

2.2.1 鹽(NaCl)存在對(duì)谷胱甘肽吸附的影響

取樹(shù)脂各2g，分別加入pH2.0的400mg/L谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL，向其中加入不同質(zhì)量的NaCl固體，吸附3h后，測(cè)定上清液中谷胱甘肽含量和Cl－含量，分別計(jì)算GSH和NaCl吸附量。對(duì)表1數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，經(jīng)t檢驗(yàn)，不同NaCl質(zhì)量濃度下所測(cè)結(jié)果差異不顯著(P＞0.05，n=5)，說(shuō)明谷胱甘肽樣品中不同質(zhì)量濃度鹽(NaCl)的存在不影響大孔吸附樹(shù)脂對(duì)谷胱甘肽的吸附，大孔吸附樹(shù)脂對(duì)鹽基本沒(méi)有吸附作用，故可以考慮用大孔樹(shù)脂脫除離子交換樹(shù)脂洗脫液中的鹽。

表1 NaCl溶液質(zhì)量濃度對(duì)SP-207吸附谷胱甘肽的影響Table 1 Effect of NaCl concentration on glutathione adsorption on SP-207 type macroporous adsorption resin

2.2.2 鹽存在下的動(dòng)態(tài)吸附曲線

80g樹(shù)脂裝入φ2.6cm×20cm層析柱，600mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液(谷胱甘肽含量400mg/L，NaCl溶液濃度1.5mol/L，pH2.0)以0.5BV上柱吸附然后用自動(dòng)部分收集器收集(10mL/管)，吸附曲線如圖1所示。

圖1 NaCl存在下谷胱甘肽動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of glutathione in the presence of NaCl

由圖1可知，NaCl幾乎在樹(shù)脂上不吸附就直接流出、濃度很快就達(dá)到最大。所以，可以考慮上柱吸附后，先用水洗出鹽，再用甲醇溶液洗脫谷胱甘肽。

2.2.3 離子交換洗脫液上柱脫鹽實(shí)驗(yàn)

圖2 SP-207脫鹽曲線Fig.2 Desalination curve of SP-207 type macroporous adsorption resin

80g樹(shù)脂裝入φ2.6cm×20cm層析柱，取50mL離子交換樹(shù)脂洗脫濃縮液(谷胱甘肽含量960mg/L，在樹(shù)脂最大吸附范圍內(nèi)，無(wú)泄漏)調(diào)節(jié)pH2.0以0.5BV上柱吸附，然后用1BV pH2.0去離子水洗脫除鹽，再用70%甲醇洗脫谷胱甘肽，然后用自動(dòng)部分收集器收集6mL/管后測(cè)定各管谷胱甘肽和Cl－含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，鹽峰和谷胱甘肽峰能完全分開(kāi)，中間采用1BV水進(jìn)行洗脫鹽已經(jīng)足夠?qū)Ⅺ}脫除，水用量太少則兩峰間會(huì)出現(xiàn)交叉、用量太大將延長(zhǎng)操作時(shí)間不利于谷胱甘肽的穩(wěn)定，故最終選擇1BV水洗脫除鹽。在此條件下，脫鹽率達(dá)到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，說(shuō)明大孔樹(shù)脂用于脫鹽效果非常理想。

3 結(jié) 論

采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)谷胱甘肽的離子交換樹(shù)脂分離洗脫液進(jìn)行了脫鹽研究，脫鹽率達(dá)到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，說(shuō)明大孔樹(shù)脂是一種非常有效的脫鹽方法。而且，大孔吸附樹(shù)脂在脫鹽的同時(shí)也能對(duì)谷胱甘肽起到一定的分離純化作用。

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Macroporous Resin Adsorption for the Desalination of Glutathione-containing Eluate from Ion-exchange Resin Column

LI Cong-jun1，XIE Ai-di2
(1. Hubei Vocational College of Bio-technology, Wuhan 430070, China；2. College of Engineering and Technology, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Q819

A

1002-6630(2010)18-0067-03

2010-06-17

李從軍(1979—)，男，助教，碩士，研究方向?yàn)樯锓蛛x純化技術(shù)。E-mail：licongjun1979@163.com