HPLC測定不同生長期及不同部位委陵菜中委陵菜黃酮的含量

黃穎瑜，唐生安，胡 瑋，段宏泉

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300070）

中藥委陵菜（Potentilla chinesis Ser.）又名白頭翁，蛤蟆草，為薔薇科植物委陵菜屬委陵菜的干燥全草。委陵菜性寒，味苦，具有清熱解毒，涼血止痢的作用[1]。研究證明其提取物具有抗糖尿病[2]，抗菌抗病毒[3-4]，保肝[5]及鎮(zhèn)痛[6]的作用。經(jīng)臨床應(yīng)用調(diào)查，在天津薊縣中醫(yī)醫(yī)院和天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院應(yīng)用于治療糖尿病，取得了較好的療效。本實(shí)驗(yàn)室在研究委陵菜抗糖尿病活性成分中得到一黃酮類主要有效成分-委陵菜黃酮，藥效學(xué)考察表明委陵菜黃酮抗糖尿病作用與二甲雙胍相當(dāng)，是中藥委陵菜抗糖尿病作用的主要有效成分[7-8]。本試驗(yàn)采集天津薊縣地區(qū)不同生長時(shí)期的委陵菜，建立高效液相色譜法測定藥材中委陵菜黃酮的含量，同時(shí)研究有效成分委陵菜黃酮在不同生長期和不同部位藥材中的含量變化，為委陵菜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與藥材 島津LC-6A高效液相色譜儀（日本島津），分析之星色譜工作站；十萬分之一電子分析天平（賽多利斯科儀器北京有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；委陵菜黃酮對照品：為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)1H-NMR及13C-NMR和MS鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC峰面積歸一化法測定其純度為99.713%，甲醇（色譜純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司），水（超純水），其他試劑均為分析純。

委陵菜，2008年采自天津薊縣，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定。

1.2 色譜條件 KromasilC18色譜柱（4.6mm×250mm,5μm,TIANHE)，甲醇-3‰冰醋酸水溶液（49:51）為流動相，流速：1ml·min-1，檢測波長：254 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μl。

1.3 溶液制備

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取委陵菜黃酮對照品2.500mg，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，使其濃度為 100μg·ml-1，搖勻，作為委陵菜黃酮對照品的儲備液。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末3.00 g，置于索氏提取器中，加甲醇100ml，回流提取4 h，回收甲醇提取液，濃縮，過濾，定容至50ml，備用。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1.5、3、6、8 至 10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻得 5、15、30、60、80 μg·ml-1對照品溶液，備用。以上各對照品溶液進(jìn)樣20μl，按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=58 560X+14 239,r=0.999 9，表明委陵菜黃酮在5~150μg·ml-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.4.2 精密度考察 對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算RSD為0.78%。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，對照品和供試品溶液各進(jìn)樣20μl，測得峰面積，計(jì)算得藥材中委陵菜黃酮的含量平均值為1.007‰，RSD為2.25%。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算RSD為2.88%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取委陵菜藥材粉末3.0 g共9份，按照藥材中委陵菜黃酮含量的80%、100%、120%加入委陵菜黃酮對照品，每個濃度各分別按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備3份供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示，80%、100%、120%委陵菜黃酮加入量 的 回 收 率 為 99.23%（RSD=1.92%）、101.48%（RSD=0.34%）、102.92%（RSD=0.74%），平均加樣回收率為101.21%，RSD為1.76%,符合含量測定方法學(xué)要求。

2 樣品測定結(jié)果

2.1 精密稱取不同月份生長的委陵菜藥材粉末，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測定色譜峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

表1 不同生長期委陵菜藥材中委陵菜黃酮的含量（‰）

2.2 精密稱取7月份采集的不同部位委陵菜藥材粉末3.0 g，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測定色譜峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 不同部位生長的委陵菜藥材中委陵菜黃酮的含量（‰）

3 討論

3.1 供試品提取方法的選擇 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)以及對委陵菜黃酮理化性質(zhì)的考察，選擇甲醇作為提取溶劑，并取10月份委陵菜分別考察了索氏回流提取、超聲提取對委陵菜藥材中委陵菜黃酮的提取率，結(jié)果顯示索式提取測得含量為0.51%，超聲提取測得含量為0.32%，表明索氏提取法委陵菜黃酮的提取率更高。

3.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化 為了盡可能獲得較好的分離效果，對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了不同組成的流動相，如甲醇-水，甲醇-冰醋酸水溶液系統(tǒng)。結(jié)果表明冰醋酸可以減少色譜峰的拖尾，使色譜峰達(dá)到較高的對稱性，改善分離度，最終確定甲醇-3‰冰醋酸水溶液（49:51）為流動相，峰形對稱性較好，無拖尾，委陵菜黃酮保留時(shí)間為25min左右。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同月份以及不同生長部位的委陵菜中委陵菜黃酮的含量存在較大差異，委陵菜黃酮的含量隨著生長時(shí)間的增加而增加，到7月份含量最高，8月份以后含量逐漸降低，而同一植株中委陵菜黃酮在葉部位含量最高，根含量最低，兩者含量差異達(dá)9倍多。國家藥典2005年版規(guī)定委陵菜于春季末抽莖時(shí)采挖，較有效成分委陵菜黃酮含量最高的7月份提前1~2個月，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為用于糖尿病治療的委陵菜藥材采集和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)制定提供了依據(jù)。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典,一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：149

[2]王琦，周玲仙，羅曉東，等.翻白草不同方法提取物對小鼠降血糖作用[J].中國公共衛(wèi)生，2007，23（2）：225

[3]向紅.民間草藥西南委陵菜抗菌作用的研究 [J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，21（2）：55

[4]張巧玲，楊占秋，陳科力.4種藥用植物提取物體外抗柯薩奇病毒 B3作用的研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，26（2）：187

[5]李貞，張鐵漢，葉亮，等.委陵菜對四氯化碳致小鼠肝損傷保護(hù)作用[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2001，12（4）：294

[6]邊可君，徐碧輝，黃開勛，等.三葉委陵菜乙醇提取物鎮(zhèn)痛作用的研究[J].江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志，2002，6（3）：200

[7]趙川，喬衛(wèi)，張彥文，等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究[J].中國中藥雜志，2008，6（33）：680

[8]段宏泉，劉普，喬衛(wèi)，等.委陵菜黃酮化合物提取分離方法和應(yīng)用[P].中國發(fā)明專利：ZL200610015591.5