反相高效液相色譜法測(cè)定飼料添加劑阿散酸中的阿散酸及摻假物質(zhì)對(duì)氨基苯磺酸

徐錦萍, 何 珩, 徐夢(mèng)依, 曲燕華

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,湖北武漢430030;2.武漢工程大學(xué)郵電與信息工程學(xué)院,湖北武漢430073)

反相高效液相色譜法測(cè)定飼料添加劑阿散酸中的阿散酸及摻假物質(zhì)對(duì)氨基苯磺酸

徐錦萍1＊, 何 珩2, 徐夢(mèng)依1, 曲燕華1

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,湖北武漢430030;2.武漢工程大學(xué)郵電與信息工程學(xué)院,湖北武漢430073)

建立了用于飼料添加劑阿散酸質(zhì)量控制的反相高效液相色譜法。采用的色譜條件:Waters Bondapak C18柱(150mm×4mm,5μm)分離,以甲醇-水(用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.9)(1∶4,v/v)作流動(dòng)相,流速1.0mL/m in,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm。在優(yōu)化的色譜條件下,阿散酸和摻假物質(zhì)對(duì)氨基苯磺酸在3m in內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離。阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸的線性范圍均為5～200m g/L,檢出限(S/N=3)分別為0.20m g/L和0.15m g/L。該方法簡(jiǎn)便快速,適合飼料添加劑阿散酸的分析以及監(jiān)測(cè)對(duì)氨基苯磺酸摻假。

反相高效液相色譜法;阿散酸;對(duì)氨基苯磺酸;摻假物質(zhì);飼料添加劑

Abstract:A reversed-phase high performance liquid Chromatographic(RP-HPLC)method was established for the determination of arsanilic acid and sulfanilic acid as adulterant in the feed additives.The separation was carried out on a Waters Bondapak C18column,and methanol water(pH2.9adjusted by0.01mol/L phosphoric acid)(1∶4,v/v)was used as the mobile phase with a flow rate of1.0mL/m in.A diode array detector was used at244nm as the detection wavelength.Arsanilic acid and sulfanilic acid were separated within3m in.The linear ranges all were5-200m g/L and the detection limits(S/N=3)were0.20and0.15m g/L for arsanilic acid and sulfanilic acid,respectively.This method is simple and rap id,and suitable for the simultaneous determination of arsanilic acid and sulfanilic acid in feed additives.

Key words:reversed-phase high perform anceliquid Chromatography(RP-HPLC);arsanilic acid;sulfanilic acid;adulterant;feed additive

阿散酸,化學(xué)名稱為對(duì)氨基苯砷酸,是豬、雞飼料的添加劑,具有促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成,改變腸道細(xì)胞的代謝,增進(jìn)皮膚卵黃素沉淀,并能抑制球蟲(chóng)卵、支原體,抗大腸桿菌,起著生長(zhǎng)促進(jìn)劑的作用,能提高產(chǎn)蛋率和飼料效率[1]。目前市場(chǎng)上以阿散酸和阿散酸-碳酸鈣預(yù)混劑產(chǎn)品為主。近來(lái),市場(chǎng)上發(fā)現(xiàn)有不法廠商在阿散酸添加劑中摻入更加價(jià)廉易得的非功能性物質(zhì)(如對(duì)氨基苯磺酸),以提高阿散酸的表觀含量,獲取不當(dāng)利益。

有關(guān)阿散酸含量的測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道得較多。美國(guó)公職化學(xué)家協(xié)會(huì)推薦的分光光度法[2]僅限于在沒(méi)有磺胺類藥物存在的條件下使用,Aschbacher等[3]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)研究阿散酸在豬、雞體內(nèi)的代謝規(guī)律,Ruiz等[4]和Roerdink等[5]用流動(dòng)注射分析法檢測(cè)了飼料和水中的阿散酸,王金榮等[6]采用HPLC檢測(cè)阿散酸,肖亞兵等[7,8]分別應(yīng)用HPLC與固相萃取、等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定飼料中阿散酸等有機(jī)胂。目前尚未見(jiàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸的報(bào)道。本文采用反相高效液相色譜(RPHPLC)同時(shí)測(cè)定阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸,為阿散酸的質(zhì)量監(jiān)控提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Agilent1100型高效液相色譜儀,配有二極管陣列紫外檢測(cè)器、20μL定量管;ZARY紫外分光光度計(jì)(瓦里安公司)。

阿散酸對(duì)照品:以98.1%阿散酸為原料,經(jīng)重結(jié)晶、干燥后,純度在99.5%以上。對(duì)氨基苯磺酸對(duì)照品:無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸(分析純,上海試劑三廠),含量不低于99.8%。磷酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純;甲醇為色譜純。阿散酸試樣購(gòu)自市場(chǎng)。

1.2 對(duì)照品與試樣溶液的制備

對(duì)照品溶液:精確稱取阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸對(duì)照品適量,分別用少量的0.1mol/L氫氧化鈉溶液溶解,用蒸餾水定容配制成約1g/L的儲(chǔ)備液。各系列對(duì)照品溶液均以儲(chǔ)備液用水稀釋后得到。

試樣溶液:精確稱取阿散酸試樣約0.1g,用少量的0.1mol/L氫氧化鈉溶液溶解,用蒸餾水于100mL容量瓶中定容。將此液用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后作為試樣溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱:Waters Bondapak C18柱(150mm×4 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-水(用稀磷酸調(diào)pH為2.9)(1∶4,v/v),流速1.0mL/m in;檢測(cè)波長(zhǎng)244 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別取阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸對(duì)照品溶液,以蒸餾水為空白,測(cè)定二者的紫外吸收光譜曲線。阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸的最大吸收峰分別為244nm與249nm,且二者的吸收強(qiáng)度和光譜曲線形狀極為相近,幾乎重疊。由此可見(jiàn),如果采用紫外分光光度法測(cè)定阿散酸的含量時(shí),若阿散酸添加劑中摻入對(duì)氨基苯磺酸則造成阿散酸的分析結(jié)果偏高,即提高了阿散酸的表觀含量。因此較阿散酸更價(jià)廉易得的對(duì)氨基苯磺酸就有可能成為阿散酸的摻假物質(zhì)。本試驗(yàn)選用244nm為檢測(cè)波長(zhǎng),并優(yōu)化其他的色譜條件使阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸充分分離,確保阿散酸測(cè)定的準(zhǔn)確性。

2.2 流動(dòng)相的選擇

甲醇水溶液是反相分配色譜中最常用的流動(dòng)相。選擇不同濃度的甲醇水溶液作流動(dòng)相的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著甲醇濃度的增大,對(duì)氨基苯磺酸與阿散酸的保留稍有減弱,分離度降低。本文最終選擇以甲醇-水(1∶4,v/v)為流動(dòng)相。

流動(dòng)相的pH對(duì)分離有明顯的影響。隨著流動(dòng)相pH值的減小,阿散酸的保留時(shí)間減小明顯。在較低pH值(如pH1.9和2.1)的條件下,對(duì)氨基苯磺酸的色譜峰出現(xiàn)明顯分叉,其原因和機(jī)理有待進(jìn)一步研究。流動(dòng)相的pH值高于3.0時(shí),阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸已經(jīng)難以達(dá)到基線分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法流動(dòng)相的適宜pH范圍為2.6～3.0,本實(shí)驗(yàn)選擇pH2.9。在1.3節(jié)所述的色譜條件下,阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸在3m in內(nèi)達(dá)到較好的分離(見(jiàn)圖1)。

圖1 阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸對(duì)照品混合溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a standard mixture ofsulfanilic acid and a rsanilic acid

2.3 工作曲線與檢出限

取質(zhì)量濃度為100m g/L的阿散酸、對(duì)氨基苯磺酸對(duì)照品溶液用水配制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合溶液,在1.3節(jié)所述的色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定。以分析物的峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x,m g/L)進(jìn)行線性回歸,得到的線性回歸方程及相關(guān)參數(shù)如表1所示,由此可見(jiàn)該方法的工作曲線線性范圍較寬,且具有較高的檢測(cè)靈敏度。

2.4 精密度

取質(zhì)量濃度為100m g/L阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸對(duì)照品溶液適量于容量瓶中定容,制備成質(zhì)量濃度均為10m g/L的溶液,按1.3節(jié)的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明,阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸峰面積測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.85%和1.03%,具有很好的重復(fù)性。

表1 阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限(S/N=3)Table1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges and detection limits(S/N=3)of a rsanilic acid and sulfanilic acid

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

稱取市購(gòu)的樣品,分別按1.2節(jié)所述的方法制備試樣溶液,測(cè)定阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸的含量,結(jié)果見(jiàn)表2。表2的結(jié)果表明,有一個(gè)試樣中未摻入對(duì)氨基苯磺酸,另外4個(gè)試樣中均含有不同量的對(duì)氨基苯磺酸。

表2 阿散酸樣品中阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸的含量(n=3)Table2 Con ten ts of a rsanilic acid and sulfanilic acid in a rsanilic acid samples(n=3)%

3 結(jié)語(yǔ)

本文采用RP-HPLC同時(shí)測(cè)定了阿散酸飼料添加劑中的阿散酸和對(duì)氨基苯磺酸,為監(jiān)測(cè)對(duì)氨基苯磺酸可能作為摻假物添加于阿散酸飼料添加劑中而影響后者的質(zhì)量提供了技術(shù)支持。方法簡(jiǎn)單、可靠、易于操作,可以用于市場(chǎng)上所銷售的飼料添加劑阿散酸中阿散酸和摻假物對(duì)氨基苯磺酸的定性和定量分析。

致謝 感謝國(guó)家飼料檢測(cè)中心的何一帆先生在測(cè)試工作中給予的指導(dǎo)與幫助。

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[8] Xiao YB,Gao J H,Zeng Y,et al.Chinese Journal of Instrumental Analysis(肖亞兵,高建會(huì),曾宇,等.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2008,27(11):1206

Determination of arsanilicacid and sulfanilic acid as adulterant in feed additives by reversed-phase high perform anceliquid chromatography

XU Jinping1＊,HE Heng2,XU Mengyi1,QU Yanhua1
(1.School of Pharmacy,Tongji Medica l College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.College of Post and Telecommunication of Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430073,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0218-03

＊通訊聯(lián)系人:徐錦萍.E-m ail:jp1129@tom.com.

2009-07-30

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00218