佟雪紅, 徐世宏 劉清華 李 軍 肖志忠 馬道遠(yuǎn)

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100039)

條斑星鰈幼魚(yú)變態(tài)期間核酸及蛋白的變化

佟雪紅1,2, 徐世宏1, 劉清華1, 李 軍1, 肖志忠1, 馬道遠(yuǎn)1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100039)

本試驗(yàn)測(cè)定了條斑星鰈(Verasper moseri)幼魚(yú)變態(tài)過(guò)程中DNA、RNA、蛋白及其比值的變化, 作為評(píng)價(jià)幼魚(yú)變態(tài)階段生長(zhǎng)潛能的指標(biāo)。結(jié)果表明, 試驗(yàn)期間培育水溫為16.5~18.0°C, DNA、RNA及蛋白的變化都帶有發(fā)育階段特異性。DNA含量在34~42日齡增加緩慢, 然后快速增加直至 44日齡, 在45日齡和46日齡分別保持下降和上升趨勢(shì)。蛋白含量和RNA含量的變化趨勢(shì)相似, 在試驗(yàn)期間保持快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。RNA/DNA比值從試驗(yàn)開(kāi)始至35日齡呈上升狀態(tài), 36日齡時(shí)下降, 38日齡時(shí)達(dá)到最高值5.01, 然后顯著下降(P<0.05), 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最低值1.76。蛋白/DNA在40日齡時(shí)達(dá)到最高值58.64, 在 46日齡時(shí)達(dá)到最低值 21.28。RNA、DNA及蛋白含量跟全長(zhǎng)和體質(zhì)量有明顯的線性關(guān)系(P<0.05)。RNA/DNA與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系比蛋白/DNA與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系密切。蛋白/DNA比值的變化趨勢(shì)跟 RNA/DNA比值類似, 但前者的變化滯后于后者, 表明 RNA/DNA比值是評(píng)價(jià)條斑星鰈生理狀況的更有效的生理指標(biāo)。

條斑星鰈(Verasper moseri); 幼魚(yú); DNA; RNA; 蛋白

魚(yú)類在仔稚魚(yú)階段對(duì)外界環(huán)境的變化很敏感,此階段以快速的生長(zhǎng)率和劇烈的形態(tài)改變?yōu)闃?biāo)志[1~3]。魚(yú)類的生長(zhǎng)可以通過(guò)體長(zhǎng)或者體質(zhì)量來(lái)度量,而后者的變化可以體現(xiàn)在仔稚魚(yú)核酸和蛋白組成的變化方面[3]。由于仔魚(yú)的形體較小, 精確測(cè)定仔稚魚(yú)形態(tài)指標(biāo)比較困難, 因此傳統(tǒng)的通過(guò)體長(zhǎng)或者體質(zhì)量衡量成魚(yú)生長(zhǎng)的方法并不適用于仔稚魚(yú)[4,5], 加之有些魚(yú)類在仔魚(yú)階段生長(zhǎng)緩慢, 降低了應(yīng)用體長(zhǎng)或體質(zhì)量來(lái)評(píng)價(jià)生長(zhǎng)的可行性[6]。所以, 借助于生化指標(biāo)來(lái)度量魚(yú)類的生長(zhǎng)是非常必要的。

近年來(lái), 利用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及生化分析等方法評(píng)價(jià)養(yǎng)殖和野生魚(yú)類仔稚魚(yú)階段生理狀況的研究逐漸開(kāi)展[7~9]。在通過(guò)傳統(tǒng)方法不能度量出魚(yú)類生長(zhǎng)的變化時(shí), 生化指標(biāo)能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到魚(yú)類生長(zhǎng)的細(xì)微變化和食物分布的波動(dòng)[10]。最近, 仔稚魚(yú)的生長(zhǎng)潛能多采用以核酸為基礎(chǔ)的指標(biāo)(例如: RNA/DNA)進(jìn)行度量, RNA/DNA比值反映了魚(yú)類蛋白的合成能力[11~16]。采用以核酸為基礎(chǔ)的指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)生長(zhǎng)的基礎(chǔ)在于動(dòng)物細(xì)胞中DNA的量是恒定的, RNA的量跟蛋白合成的速度緊密相連[2]。由于仔魚(yú)的生長(zhǎng)依賴于蛋白的合成, 而且以核酸為基礎(chǔ)的參數(shù)對(duì)仔稚魚(yú)的攝食變化反映靈敏, 因此以核酸為基礎(chǔ)的指標(biāo)是評(píng)價(jià)仔稚魚(yú)生長(zhǎng)的有效參數(shù)[17~19]。國(guó)內(nèi), 趙玲等[20]對(duì)鰱(Hypophthalmichehys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)的研究,羅莉等[21]對(duì)草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)的研究以及梁萌青等[22]鲀對(duì)紅鰭東方 (Takifugu rubripes)的研究均表明, RNA/DNA 比值是一個(gè)非常靈敏地反映魚(yú)類生長(zhǎng)的指標(biāo)。另外, RNA/DNA 比值還可以推斷天然水域中魚(yú)類幼體的營(yíng)養(yǎng)狀況以及是否處于饑餓狀態(tài)[23]。RNA/DNA 比值還被用來(lái)作為評(píng)價(jià)魚(yú)用配合飼料優(yōu)劣的指標(biāo)和衡量水環(huán)境的指標(biāo), 能在一定條件下預(yù)測(cè)污染與否以及水環(huán)境是否有利于魚(yú)類的生長(zhǎng)[24,25]。因此, RNA/DNA比值在水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)和研究中是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。

條斑星鰈(Verasper moseri)俗稱“花豹子”、“花邊爪”, 屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈科(Pleuronectidae)、星鰈屬(Verasper), 主要分布于日本茨城縣以北到鄂霍茨克海以南海域, 中國(guó)黃渤海海域亦有少量分布, 為冷溫性大型底棲魚(yú)類。變態(tài)期往往伴隨著營(yíng)養(yǎng)危機(jī)和高的死亡率, 是鲆鰈魚(yú)類早期發(fā)育階段的關(guān)鍵期, 并決定著年產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)收益[26~28]。因此, 評(píng)價(jià)此階段仔稚魚(yú)的生理狀況和生長(zhǎng)潛能是非常必要的。本試驗(yàn)的目的在于探索條斑星鰈變態(tài)階段核酸和總蛋白的變化規(guī)律, 明確生化指標(biāo)跟生長(zhǎng)的相關(guān)關(guān)系, 從而建立生化指標(biāo)評(píng)價(jià)仔稚魚(yú)生理狀況的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 仔稚魚(yú)的培育

實(shí)驗(yàn)所用條斑星鰈魚(yú)苗取自山東煙臺(tái)東方海洋科技股份有限公司。樣品為孵化后 34~46日齡的魚(yú)苗。仔稚魚(yú)在16 m3的水泥池中流水培育, 培育時(shí)的水質(zhì)條件是: 水溫為 16.5~18.0 °C, 溶氧為 7.0~8.5 mg/L, 鹽度為30~32, pH為7.7~8.0。試驗(yàn)期間投喂人工配合餌料。

1.2 樣品采集和保存

試驗(yàn)自魚(yú)苗孵化后34 d開(kāi)始至46 d結(jié)束。2 d取樣1次, 8: 00定點(diǎn)取樣45尾, 其中15尾先用丁香酚麻醉, 再用冰冷的去離子水沖洗并快速凍于液氮中保存, 用于測(cè)定 RNA、DNA及蛋白。其余的 30尾用于測(cè)定全長(zhǎng)、體長(zhǎng)及體質(zhì)量。

1.3 核酸及蛋白的測(cè)定

參照Buckley[29]和Kuropat等[30]的方法, 采用整體勻漿法提取條斑星鰈仔稚魚(yú)的核酸和蛋白。用GeneQuantpro紫外分光光度計(jì)測(cè)定各自的 A260值,并計(jì)算RNA 和DNA 的含量。依據(jù)Bradford[31]的方法測(cè)定蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 11.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件中 One-way ANOVA分別分析核酸及蛋白在不同生長(zhǎng)時(shí)期的差異顯著性, 當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 條斑星鰈的生長(zhǎng)變化

條斑星鰈變態(tài)期間體長(zhǎng)和體質(zhì)量的變化見(jiàn)圖1。魚(yú)苗34日齡時(shí)開(kāi)始變態(tài), 44日齡時(shí)變態(tài)結(jié)束。變態(tài)開(kāi)始時(shí)體質(zhì)量和體長(zhǎng)分別是23.5mg、1.1cm。體質(zhì)量的增長(zhǎng)程度高于體長(zhǎng)的增長(zhǎng)程度。變態(tài)高峰期時(shí), 體長(zhǎng)和體質(zhì)量增長(zhǎng)迅速; 變態(tài)結(jié)束時(shí), 體長(zhǎng)和體質(zhì)量的增長(zhǎng)速度變慢。

2.2 核酸及蛋白的變化

本論文采用兩種單位(質(zhì)量比和含量)分別來(lái)闡述 DNA、RNA及蛋白的變化規(guī)律。質(zhì)量比表示為μg/mg 濕質(zhì)量, 指的是每毫克體質(zhì)量下DNA、RNA及蛋白的量; 含量表示為μg/尾, 指的是每尾魚(yú)所具有的DNA、RNA及蛋白的量。

圖1 條斑星鰈仔稚魚(yú)體質(zhì)量和體長(zhǎng)的變化Fig. 1 Changes in body weight and body length of barfin flounder larvae and juveniles

圖2 條斑星鰈仔稚魚(yú)DNA, RNA和蛋白質(zhì)量比的變化平均值后字母不同者表示差異顯著, 圖3、圖4同F(xiàn)ig. 2 Changes in DNA, RNA and protein concentrations of barfin flounder larvae and juvenilesMeans followed by different letters are significantly different

DNA質(zhì)量比在32至42日齡期間保持恒定, 在44日齡時(shí)顯著上升(P<0.05), 然后呈下降趨勢(shì), 在46日齡時(shí)數(shù)值升至最高(圖2)。RNA質(zhì)量比從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始至變態(tài)高峰期增長(zhǎng)快速, 之后逐漸下降。蛋白質(zhì)量比在40日齡之前保持波動(dòng)狀態(tài), 然后維持在較高的穩(wěn)定水平。

DNA、RNA及蛋白含量在試驗(yàn)期間均保持快速增長(zhǎng)的趨勢(shì), 在 40~44日齡期間增加顯著(P<0.05),但在45日齡時(shí)緩慢下降(圖3)。

圖3 條斑星鰈仔稚魚(yú)DNA, RNA和蛋白含量的變化Fig. 3 Changes in DNA, RNA and protein contents of barfin flounder larvae and juvenilesMeans followed by different letters are significantly different

2.3 RNA/DNA和蛋白/DNA的變化

RNA/DNA比值在試驗(yàn)期間保持波動(dòng)趨勢(shì)(圖4),試驗(yàn)開(kāi)始至35日齡該比值呈上升狀態(tài), 36日齡時(shí)下降, 在 38日齡時(shí)達(dá)到最高值 5.01, 然后顯著下降(P<0.05), 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最低值1.76。蛋白/DNA變化趨勢(shì)跟RNA/DNA變化趨勢(shì)類似, 在40日齡時(shí)達(dá)到最高值58.64, 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最低值21.28。

圖4 條斑星鰈仔稚魚(yú)蛋白/DNA和RNA/DNA的變化Fig. 4 Changes in protein/DNA and RNA/DNA ratios of barfin flounder larvae and juvenilesMeans followed by different letters are significantly different

2.4 DNA、RNA、蛋白及其比值與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)中, 以核酸為基礎(chǔ)的指標(biāo)與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系見(jiàn)圖5和表1。DNA、RNA及蛋白含量跟全長(zhǎng)有明顯的線性關(guān)系,R2分別是 0.772、0.921、0.906 (P<0.05)。DNA、RNA及蛋白含量跟體質(zhì)量也有明顯的線性關(guān)系,R2分別是 0.851、0.987、0.985(P<0.05)。RNA/DNA與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的線性關(guān)系R2分別是0.465、0.531; 蛋白/DNA與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的線性關(guān)系R2分別是0.337、0.377; RNA/DNA與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系比蛋白/DNA與全長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系密切。蛋白增長(zhǎng)率與全長(zhǎng)和體質(zhì)量無(wú)明顯的線性關(guān)系,R2分別為0.06、0.025。

表1 蛋白含量、以核酸為基礎(chǔ)的指標(biāo)及蛋白增長(zhǎng)率與條斑星鰈仔稚魚(yú)全長(zhǎng)和體質(zhì)量的回歸關(guān)系Tab. 1 Regression equations of protein, the nucleic acids-based indices or Gpi with total length and body weight of barfin flounder larvae and juveniles

3 討論

3.1 條斑星鰈變態(tài)期間核酸及蛋白的變化

核酸在魚(yú)類的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。DNA的量反映了魚(yú)體的細(xì)胞數(shù)量, 而RNA的量則跟細(xì)胞中蛋白的合成直接相關(guān)[2]。本試驗(yàn)中, RNA質(zhì)量比在 38日齡之前呈上升趨勢(shì), 然后下降, 而DNA質(zhì)量比在此期間幾乎沒(méi)有變化, 表明從變態(tài)開(kāi)始至變態(tài)高峰期, 條斑星鰈的生長(zhǎng)以細(xì)胞增大為主;魚(yú)類變態(tài)是一個(gè)耗能的過(guò)程, 所以, 變態(tài)后期 RNA量會(huì)降低[27]。RNA和蛋白含量在條斑星鰈變態(tài)期間呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì), 這可能與鲆鰈類變態(tài)期間內(nèi)臟器官的發(fā)育和完善密切相關(guān)[2,32]。本實(shí)驗(yàn)中蛋白含量的變化趨勢(shì)跟RNA含量的變化趨勢(shì)類似, 說(shuō)明RNA含量變化反映了魚(yú)體蛋白合成的多少。

圖5 條斑星鰈仔稚魚(yú)全長(zhǎng)和體質(zhì)量與蛋白、RNA、DNA、RNA/DNA、Gpi及蛋白/DNA的關(guān)系Fig. 5 Relationships of protein, RNA, DNA, RNA/DNA, Gpi or protein/DNA with total length and body weight of barfin flounder larvae and juveniles

DNA含量是生物體內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的指示因子[32]。42日齡時(shí) DNA含量的急劇增長(zhǎng)可能預(yù)示了此時(shí)條斑星鰈魚(yú)苗比較脆弱[33], 對(duì)外界反映很敏感, 該時(shí)期條斑星鰈正經(jīng)歷由浮游狀態(tài)到底棲狀態(tài)的改變。本實(shí)驗(yàn)中以核酸為基礎(chǔ)的指標(biāo)從細(xì)胞水平上反映了條斑星鰈的生長(zhǎng)特性: 條斑星鰈變態(tài)期間的生長(zhǎng)以細(xì)胞增大為主, 而在變態(tài)后的生長(zhǎng)以細(xì)胞增殖為主。與在牙鲆中得出的試驗(yàn)結(jié)果類似[1], 本試驗(yàn)中 DNA和RNA含量的變化跟發(fā)育階段和仔稚魚(yú)大小密切相關(guān)。另外, 鲆鰈類變態(tài)期間, 內(nèi)在器官經(jīng)歷分化和成熟的過(guò)程[34], 因此, 本試驗(yàn)中RNA和DNA含量的變化跟此發(fā)育階段器官的分化增殖也有一定聯(lián)系。

3.2 條斑星鰈變態(tài)期間 RNA/DNA比值的變化

RNA/DNA是生物體中細(xì)胞代謝強(qiáng)度的指示指標(biāo), 因此常被用來(lái)評(píng)價(jià)魚(yú)類的生理狀況[35]。本實(shí)驗(yàn)中RNA/DNA呈波動(dòng)性變化, 主要是由于 RNA含量波動(dòng)和DNA含量相對(duì)穩(wěn)定的緣故。該比值在36日齡時(shí)急劇下降, 原因在于此時(shí) RNA量的下降和 DNA量的增長(zhǎng), 由此進(jìn)一步說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞增殖的速度要高于蛋白合成的速度[1]。在38日齡時(shí), RNA/DNA比值上升至最高峰, 表明此時(shí)蛋白合成的速度快于細(xì)胞增殖的速度, 合成的蛋白可能跟變態(tài)高峰時(shí)器官的分化增殖有關(guān)。RNA/DNA比值在變態(tài)后顯著下降,表明細(xì)胞中蛋白合成的降低和細(xì)胞數(shù)目的增多, 這可能跟此時(shí)期條斑星鰈稚魚(yú)生長(zhǎng)方式由浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞钏殡S的能量消耗有關(guān)。本研究中,RNA/DNA比值隨魚(yú)體增大呈下降趨勢(shì), Kimura等[35]在評(píng)價(jià)日本沙丁魚(yú)初次攝食時(shí)的營(yíng)養(yǎng)狀況時(shí), 以及Clemmesen[36]在分析餌料分布對(duì)青魚(yú) RNA/DNA 比值的影響時(shí), 均得出了類似結(jié)果。

對(duì)牙鲆進(jìn)行的相關(guān)研究顯示, RNA/DNA有一個(gè)關(guān)鍵的臨界值為2.49[1,37], RNA/DNA低于此臨界值的牙鲆仔稚魚(yú)處于“亞健康”狀態(tài)或者饑餓狀態(tài)。本研究中, 條斑星鰈從38日齡開(kāi)始RNA/DNA比值急劇下降, 而且在44日齡后該比值均維持在2左右,這可以從條斑星鰈生活習(xí)性的改變上得到解釋, 條斑星鰈變態(tài)后將由浮游生活轉(zhuǎn)為伏底生活, 棲息環(huán)境的轉(zhuǎn)變可能會(huì)影響條斑星鰈的攝食并進(jìn)一步導(dǎo)致生理狀況和營(yíng)養(yǎng)水平的急劇變化, 從而使得 RNA/DNA下降至臨界值周圍。因此, 剛伏底的一段時(shí)間往往是條斑星鰈的死亡高發(fā)期。

3.3 條斑星鰈變態(tài)期間蛋白/DNA比值的變化

蛋白/DNA是生物體中細(xì)胞大小或者細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo), 因?yàn)榈鞍渍紦?jù)了細(xì)胞的絕大部分質(zhì)量[32]。38日齡時(shí)蛋白/DNA比值明顯下降, 主要是由于變態(tài)高峰期時(shí)的巨大能量消耗和器官分化所需要的細(xì)胞快速增殖所致。而在40日齡該比值達(dá)到最高峰, 原因在于生物體快速合成了大量蛋白以應(yīng)對(duì)伏底期的營(yíng)養(yǎng)危機(jī)。條斑星鰈轉(zhuǎn)入伏底后, 生物體將大量耗能,表現(xiàn)為蛋白/DNA比值的急劇下降。Fukuda等[32]發(fā)現(xiàn), 施氏鰈(Pleuronectes schrenki)在變態(tài)后蛋白/DNA比值也呈下降趨勢(shì)。蛋白/DNA跟RNA/DNA的變化趨勢(shì)相似, 但在時(shí)間上相對(duì)滯后, 說(shuō)明RNA/DNA是評(píng)價(jià)條斑星鰈生理狀況和生長(zhǎng)的更有效的指標(biāo)。

以上結(jié)果表明, 條斑星鰈變態(tài)期間的生長(zhǎng)以細(xì)胞增大為主, 而在變態(tài)后的生長(zhǎng)以細(xì)胞增殖為主,以核酸為基礎(chǔ)的指標(biāo)可以從細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)條斑星鰈仔稚魚(yú)的生長(zhǎng)。

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Changes in nucleic acids and protein indices during metamorphosis of barfin flounder Verasper moseri

TONG Xue-hong1,2, XU Shi-hong1, LIU Qing-hua1, LI Jun1, XIAO Zhi-zhong1,MA Dao-yuan1
(1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China ; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Mar., 15, 2010

barfin flounder (Verasper moseri); juvenile ; DNA ; RNA ; protein

Changes in DNA, RNA, protein and their ratios of barfin flounder Verasper moseri during metamorphosis were determined, and were used to evaluate the growth potential of barfin flounder at this stage. Water temperature fluctuated between 16.5°C and 18.0°C. Patterns of DNA, RNA and protein parameters all showed developmental stages-specific traits. DNA content remained slight increase until 42 days after hatching (DAH) and showed abrupt rise towards 44 DAH followed by a drop and a rise around 45 and 46 DAH, respectively. The changes in protein content coincided well with those of RNA content; and they both kept obvious increases throughout the experimental period. RNA/DNA ratio increased up to 35 DAH, but decreased at 36 DAH, and reached the climax of 5.01 at 38 DAH, which was followed by a significant decline with the minimum value of 1.76 at the end of the experiment. Protein/DNA reached the maximum value of 58.64 at 40 DAH and the minimum value of 21.28 at 46 DAH. DNA, RNA and protein contents all showed significant correlations with total length and body weight of barfin flounder (P<0.05). RNA/DNA had stronger correlations with total length and body weight of barfin flounder than protein/DNA. Protein/DNA showed a similar pattern to RNA/DNA, but the changes in protein/DNA lagged behind those in RNA/DNA, suggesting that RNA/DNA ratio is a more sensitive index than protein/DNA ratio in evaluating physiological conditions of barfin flounder.

Q955

A

1000-3096(2010)05-0041-07

2010-03-15;

2010-03-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(nycytx-50);國(guó)家863“十一五”計(jì)劃資助項(xiàng)目(2006AA10A404)

佟雪紅(1979-), 女, 山東濰坊人, 博士研究生, 研究方向:海洋生物學(xué), 電話: 0532-82898716, E-mail: txh113005@163.com; 李軍,通信作者, 研究員, E-mail: junli@ms.qdio.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)