VC脂質(zhì)體的制備與穩(wěn)定性測(cè)定

楊水兵，劉成梅*，劉 偉，劉瑋琳，童桂鴻，章 瑜，鄭會(huì)娟

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

VC脂質(zhì)體的制備與穩(wěn)定性測(cè)定

楊水兵，劉成梅*，劉 偉，劉瑋琳，童桂鴻，章 瑜，鄭會(huì)娟

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

以卵磷脂和膽固醇為膜材，采用薄膜-超聲法制備VC脂質(zhì)體。通過單因素考察生產(chǎn)工藝對(duì)包封率的影響以及正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行工藝優(yōu)化。得出制備VC脂質(zhì)體最佳工藝：制備溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材:VC=25:1、總脂材:表面活性劑(吐溫-80)=10:2，在此條件下包封率可達(dá)42.1%，平均粒度為373.9nm；將脂質(zhì)體在4℃下密閉放置15d，以脂質(zhì)體的粒徑變化為指標(biāo)考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，脂質(zhì)體懸液粒徑無明顯變化，脂質(zhì)體懸液穩(wěn)定性良好。

VC；脂質(zhì)體；薄膜水化法；包封率；穩(wěn)定性

VC是一種水溶性的維生素，它可合成膠原蛋白和黏多糖，減少自由基對(duì)皮膚的損害，延緩衰老，還可抑制皮膚異常色素的沉積和酪氨酸酶的活性，減少黑色素的形成，被廣泛應(yīng)用在美白和抗氧化護(hù)膚化妝品中[1-2]。人體對(duì)VC的全部需要量都由食物供給，食物中的VC可迅速被胃腸道吸收。但在某些特殊情況下，如腹瀉、腸手術(shù)、養(yǎng)料吸收障礙、胃腸炎、消化道潰瘍等情況下會(huì)使VC的吸收減少。VC性質(zhì)不穩(wěn)定，在儲(chǔ)藏和加工過程中受熱、見光易氧化、分解，導(dǎo)致其利用率顯著降低[3-4]。VC是水溶性的，不易滲透到皮膚角質(zhì)層，故不能充分發(fā)揮效用。

為減少維生素的損失，提高其在人體中的吸收利用率，本研究將VC包裹在脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體不同于普通的膏霜基質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)類似生物膜，又稱人工生物膜，在水中平衡后具有親水性和疏水性兩性性質(zhì)。它是以生物相容的磷脂和膽固醇為載體，將藥物溶解或包裹于脂質(zhì)核，或是吸附、附著于納米粒表面的一種新型載藥系統(tǒng)，具有緩釋、控釋、提高藥物穩(wěn)定性，增強(qiáng)療效降低毒副作用等方面的優(yōu)越性，同時(shí)在生物體內(nèi)及貯存過程中較穩(wěn)定[5-6]。

脂質(zhì)體常用的制備方法有薄膜法[7]、超聲法[8]、乙醇注入法[9]、高壓乳勻法等[10]。薄膜法制備的脂質(zhì)體包封率較高，但一般粒徑較大。超聲法制備的脂質(zhì)體粒徑較小，但其包封率低，且不穩(wěn)定[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合脂質(zhì)體作為新型藥劑載體的優(yōu)越性，以大豆卵磷脂和膽固醇作為膜材，采用薄膜-超聲法制備包封率高、穩(wěn)定性好的VC脂質(zhì)體，為VC脂質(zhì)體的生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆磷脂(純度＞92%) 北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司；膽固醇 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；VC、固藍(lán)B鹽 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80 上海申字醫(yī)藥化工有限公司；EDTA 成都科龍化工試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、冰乙酸天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHE-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器廠；KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Nicomp380 ZLS超細(xì)微粒粒度分析儀美國(guó)Santa barbara公司；漩渦混勻器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；T6紫外-可見分光光度計(jì) 普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 VC脂質(zhì)體的制備[12-13]

稱取一定比例大豆磷脂、膽固醇，置于250mL梨型瓶中；加入無水乙醇溶解，將梨形瓶置于65℃水浴中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完，形成脂質(zhì)干膜后，關(guān)閉旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；加入含一定量VC及表面活性劑吐溫-80的PBS，在減壓的條件下旋轉(zhuǎn)洗膜15min，形成乳白色懸濁液；將乳白色懸濁液轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中，經(jīng)過超聲處理即形成均勻的白色脂質(zhì)體乳濁液。以包封率和粒徑為考察指標(biāo)，篩選包封VC的最佳配方。

1.3.2 脂質(zhì)體的粒徑測(cè)定[14-15]

將脂質(zhì)體以緩沖液稀釋后，用激光納米粒度分析儀測(cè)定其粒徑及粒徑分布。測(cè)試角度90°，測(cè)試溫度為(25±0.1)℃，測(cè)試光波長(zhǎng)為632.8nm。

1.3.3 脂質(zhì)體包封率測(cè)定

1.3.3.1 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

圖1 VC含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of vitamin C

精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(相當(dāng)于抗壞血酸0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、150.0、200.0μg)，分別置于10mL比色管中。各加0.3mL EDTA溶液(0.25mol/L)、0.5mL乙酸溶液(0.5mol/L)、1.25mL固藍(lán)B鹽溶液(2g/L)，加水稀釋至刻度，用漩渦混勻器混勻。室溫(20～25℃)下放置20min后，移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)420nm處測(cè)量吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由圖1可知，在測(cè)定范圍內(nèi)，吸光度(y)與溶液中VC含量(x)滿足線性關(guān)系，y=0.0078x－0.0110，R2=0.9986，相關(guān)性很高。

1.3.3.2 包封率測(cè)定(透析-分光光度法)

取脂質(zhì)體懸浮液10mL置于已處理過的透析袋(cut off范圍12000～14000)中，封口，將其置于燒杯中，于室溫下透析10h。取出1mL透析內(nèi)液，測(cè)定波長(zhǎng)420nm處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出包封的VC含量，從而計(jì)算出VC的包封率[16]。

式中：m包、m總分別表示包封于脂質(zhì)體的VC含量及總VC用量。

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

分別以制備溫度、卵磷酯與膽固醇質(zhì)量比(卵膽比)、表面活性劑(吐溫-80)用量、無水乙醇用量、VC與總脂材比為因素，考察各因素對(duì)脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響。1.3.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)脂質(zhì)體包封率和粒徑影響較大的4個(gè)因素(VC含量、卵磷脂與膽固醇的比例、制備溫度以及表面活性劑加入量)，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳制備溫度的確定

圖2 制備溫度對(duì)包封率、粒徑的影響Fig.2 Effect of preparation temperature on encapsulation efficiency and particle size

在VC質(zhì)量濃度2mg/mL、卵磷脂:膽固醇=4:1、卵磷脂:無水乙醇=2.5g/100mL、表面活性劑:總脂材=3:10、VC:總脂材=1:10(即卵磷脂1.6g、膽固醇0.4g、無水乙醇64mL、表面活性劑0.6g和VC 0.2g)條件下，考察制備溫度50、55、60、65、70℃對(duì)包封率及粒徑的影響，結(jié)果見圖2。

結(jié)合包封率和粒徑這兩個(gè)因素的變化，50～65℃之間包封率總體呈上升趨勢(shì)，而大于65℃則開始下降，粒徑隨溫度升高而增大，于60℃達(dá)到最大，超過60℃開始減小。雖然65℃粒徑不是最小值，但是其與最小值較接近，而且包封率為最大，故取65℃為制備溫度。脂質(zhì)體的物理性質(zhì)與介質(zhì)溫度有密切關(guān)系，當(dāng)升高溫度時(shí)脂質(zhì)體雙分子層中疏水鏈可從有序排列變?yōu)闊o序排列，從而引起脂質(zhì)膜物理性質(zhì)的一系列變化，膜由“膠晶”態(tài)變?yōu)椤耙壕А睉B(tài)，其厚度減小、流動(dòng)性增加等，發(fā)生這種轉(zhuǎn)變時(shí)的溫度稱為相變溫度。

在相變溫度以下時(shí)，膜結(jié)構(gòu)處于晶態(tài)；在相變溫度以上時(shí)，處于流體態(tài)和液晶態(tài)。當(dāng)發(fā)生相變時(shí)，可有液態(tài)、液晶態(tài)和晶態(tài)共存，出現(xiàn)相分離現(xiàn)象，使膜的通透性增加，被包裹物滲漏，故膜的流動(dòng)性直接影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。除此之外，過高溫度會(huì)造成VC的損失，而過低溫度成膜時(shí)間長(zhǎng)且不均勻，故選取65℃為制備溫度。

2.2 卵膽比對(duì)包封率、粒徑的影響

在VC質(zhì)量濃度2mg/mL、卵磷脂:膽固醇=4:1、卵磷脂:無水乙醇=2.5g/100mL、表面活性劑:總脂材=3:10、VC:總脂材=1:10和溫度65℃條件下，考察以卵磷脂:膽固醇為2:1、3:1、4:1、5:1、6:1制備VC脂質(zhì)體，對(duì)其包封率、粒徑的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 卵膽比對(duì)包封率、粒徑的影響Fig.3 Effect of phospholipids/cholesterol ratio on encapsulation efficiency and particle size

膽固醇對(duì)磷脂的相變具有雙向調(diào)節(jié)作用。在相變溫度以上時(shí)，它能抑制磷脂分子中脂肪酰鏈的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化運(yùn)動(dòng)，降低膜的流動(dòng)性；在相變溫度以下時(shí)，膜脂處于晶態(tài)排列，它又可誘發(fā)脂肪酰鏈的歪扭構(gòu)象的產(chǎn)生，阻止晶態(tài)的出現(xiàn)。膽固醇分子中的羥基還可與磷脂分子中的羰基以氫鍵形成復(fù)合物。脂肪酰鏈自由運(yùn)動(dòng)的減少，引起膜的壓縮，面積減小，結(jié)合緊密，流動(dòng)性降低而使?jié)B透性降低。

而在一定比例范圍內(nèi)，膽固醇比例越大，包封率越高，因?yàn)槟懝檀急砻婊钚詣┳饔檬筗/O乳液能穩(wěn)定形成；但膽固醇比例過大時(shí)，組成脂質(zhì)體的磷脂量太少，脂質(zhì)體膜形成困難，而且不牢固，且由此形成的脂質(zhì)體膜親水性太強(qiáng)，膜也容易破壞。綜上，并結(jié)合以上圖形可知，當(dāng)卵磷脂:膽固醇小于5:1，包封率一直上升，于5:1達(dá)到最大，隨后開始呈下降趨勢(shì)。當(dāng)卵磷脂:膽固醇=5:1時(shí)粒徑為最小值，大于此值時(shí)粒徑增大。故選取制備脂質(zhì)體適宜的卵膽比為5:1。

2.3 表面活性劑與總脂材的比對(duì)包封率、粒徑的影響

在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、VC:總脂材=1:20條件下，固定其他組分的比例不變，只改變表面活性和總脂材的比例，制備VC脂質(zhì)體，研究表面活性劑[17]對(duì)包封率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 表面活性劑與總脂材的比對(duì)包封率、粒徑的影響Fig.4 Effect of total lipid/surfactant ratio on encapsulation efficiency and particle size

聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，吐溫-80是一種非離子型親水性表面活性劑，含親水性和疏水性的長(zhǎng)鏈。脂質(zhì)體中加入吐溫-80后，吐溫-80物理吸附于脂質(zhì)雙層表面，其聚氧乙烯基從脂質(zhì)雙層中伸出，致密覆蓋在雙層表面，形成有一定厚度的親水相。它屬于“立體屏障”型脂質(zhì)體，比傳統(tǒng)脂質(zhì)體更穩(wěn)定。但是過多的加入其會(huì)造成脂質(zhì)體的泄露，當(dāng)表面活性劑:總脂材小于3:10時(shí)，包封率隨之增大而上升，超過其則下降，粒徑在其值小于3:10時(shí)一直下降，大于其則上升，所以取表面活性劑:總脂材=3:10為佳。

2.4 無水乙醇用量的確定

在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、VC:總脂材=1:20條件下，固定其他組分的比例不變，只改變卵磷脂和無水乙醇的比例，制備VC脂質(zhì)體，研究乙醇用量對(duì)成膜、包封率及粒徑的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 磷脂與無水乙醇用量比(g/100mL)對(duì)包封率及粒徑的影響Fig.5 Effect of phospholipids/alcohol ratio on encapsulation efficiency and particle size

無水乙醇作為成膜時(shí)的有機(jī)溶劑，對(duì)成膜均勻度，成膜好壞有最直接的影響，少量無水乙醇不能溶解磷脂，過多的無水乙醇則不易除去，均會(huì)影響到脂質(zhì)體的均勻性，且由于其為有機(jī)溶劑，用量過多會(huì)造成試劑殘留。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，在比例為2.5g/100mL時(shí)，包封率為最大值，粒徑為最小值，經(jīng)試驗(yàn)確定最后用量為2.5g/100mL為最佳。

2.5 VC與總脂材的比對(duì)包封率及粒徑的影響

在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1條件下，固定其他組分的比例不變，只改變VC和總脂材的比例，制備VC脂質(zhì)體，研究VC與總脂材的比[18](質(zhì)量比)對(duì)包封率和粒徑的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 總脂材與VC比對(duì)包封率及粒徑的影響Fig.6 Effect of total lipid/vitamin C ratio on encapsulation efficiency and particle size

VC與總脂材的比對(duì)脂質(zhì)體的外觀和包封率影響也較大，隨著大豆卵磷脂比的增加，包封率增大，粒徑也同時(shí)增大，但是VC與總脂材的比過大則VC容易析出，不能制成較好的VC脂質(zhì)體，包封率不高；比例過小制得的脂質(zhì)體外觀不均勻，粒徑較大，且由于磷脂、膽固醇量較大造成絕對(duì)包封量少。綜合這兩方面因素，取總脂材:VC=20:1為制備比例。

2.6 VC脂質(zhì)體正交試驗(yàn)

通過正交設(shè)計(jì)確定VC脂質(zhì)體配方。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定了影響VC脂質(zhì)體包封率主要因素：體系中VC的含量、卵磷脂與膽固醇的比例、制備溫度以及表面活性劑加入量。因此，用L9(34)表正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)(表1)，確定VC脂質(zhì)體的最佳配方。

表1 VC脂質(zhì)體正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

按上述方法測(cè)定正交設(shè)計(jì)法中每個(gè)組處方制備出的脂質(zhì)體中VC的含量。結(jié)果見表2。

表2 VC脂質(zhì)體正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for encapsulation efficiency with various preparation conditions

從表2和表3可以看出，影響因素主次順序?yàn)镈＞C＞B＞A。最佳組合為A2B2C3D1，即溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材: VC =25:1、表面活性劑:總脂材=2:10，此組合下得到的包封率可達(dá)42.1%。

2.7 脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性[19-20]

對(duì)按最優(yōu)試驗(yàn)組制備的脂質(zhì)體懸液置于4℃下貯藏，并于不同時(shí)間(0、3、6、9、12、15d)取樣進(jìn)行粒徑測(cè)定，結(jié)果見表4。最優(yōu)試驗(yàn)組：磷脂:膽固醇=5:1、總脂材: VC =25:1、表面活性劑:總脂材=2:10、制備溫度65℃，與正交分析最佳組合組相一致。

表4 貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 4 Storage stability of vitamin C liposomes

由表4可知，脂質(zhì)體儲(chǔ)藏時(shí)會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)造成絮凝結(jié)塊，而在冷藏條件下可延緩此變化，從粒徑出發(fā)考察了該脂質(zhì)體在冷藏條件下的粒徑變化以得到其冷藏穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)粒徑在15d內(nèi)變化不大，可說明脂質(zhì)體的冷藏穩(wěn)定性較好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以卵磷脂、膽固醇為膜材，VC為芯材，采用單因素考察和正交設(shè)計(jì)對(duì)薄膜水化-超聲法進(jìn)行了制備工藝的優(yōu)化，得到的最佳工藝條件：制備溫度為65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材:VC=25:1、總脂材:表面活性劑=10:2，在此條件下脂質(zhì)體包封率可達(dá)42.1%，平均粒度為373.9nm；且脂質(zhì)體在4℃下貯藏，15d內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

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Preparation and Stability of Vitamin C Liposomes

YANG Shui-bing，LIU Cheng-mei*，LIU Wei，LIU Wei-lin，TONG Gui-hong，ZHANG Yu，ZHENG Hui-juan
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Lecithin and cholesterol were used the membrane-forming materials to prepare vitamin C liposomes by thin film hydration-ultrasonic method. Based on single-factor experiments, the optimal preparation conditions for vitamin C liposomes were determined by orthogonal array design to be preparation temperature, 65 ℃; lecithin/cholesterolthe mass ratio, 5:1; total lipid/vitamin C mass ratio, 25:1; and total lipid/ surfactant mass ratio 10: 2. An encapsulation efficiency of vitamin C liposomes as high as 42.1% was achieved under these optimal preparation conditions, and the average particle size of the prepared vitamin C liposomes was 373.9 nm. The stability of vitamin C liposomes was investigated by evaluating the change of its average particle size during storage at 4 ℃ for 15 days. The average particle size of vitamin C liposomes had no significant change, suggesting excellent stability.

vitamin C；liposome；thin film hydration-ultrasonic method；encapsulation efficiency；stability

R944.1

A

1002-6630(2010)20-0230-05

2010-07-08

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z330)；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200808)作者簡(jiǎn)介：楊水兵(1984—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槭澄?含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。

E-mail：shuibingyang1984@126.com

*通信作者：劉成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭澄?含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn